1.一种人参细胞工程化肿瘤疫苗,其特征在于,包括源自可表达肿瘤抗原的重组人参细胞的外泌体;所述可表达肿瘤抗原的重组人参细胞是将包含肿瘤抗原DNA的重组质粒导入人参细胞中而得到。
2.根据权利要求1所述的人参细胞工程化肿瘤疫苗,其特征在于,所述人参细胞工程化肿瘤疫苗的剂型包括注射剂。
3.根据权利要求1所述的人参细胞工程化肿瘤疫苗,其特征在于,所述肿瘤抗原包括从患肿瘤个体的肿瘤组织中经测序和生物信息学鉴定后得到的个性化肿瘤抗原。
4.权利要求1-3任一所述的人参细胞工程化肿瘤疫苗的制备方法,其特征在于,包括:构建包含肿瘤抗原DNA的重组质粒,将重组质粒导入人参细胞形成可表达肿瘤抗原的重组人参细胞;培养所述重组人参细胞,提取其外泌体,得到人参细胞工程化肿瘤疫苗。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述构建包含肿瘤抗原DNA的重组质粒包括:使用逆转录酶和寡引物,将未经末端修饰的肿瘤抗原mRNA逆转录成单链cDNA,以单链cDNA为模板,通过DNA聚合酶合成第二链cDNA,形成肿瘤抗原的双链cDNA;采用连接酶,在cDNA末端添加attB1及attB2接头;采用限制性内切酶,将修饰后的cDNA与质粒载体相连,得到包含肿瘤抗原DNA的重组质粒。
6.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述将重组质粒导入人参细胞的导入方法包括电穿孔、基因枪注射、植物感受态转染、农杆菌侵染、阳离子脂质转染或病毒转染。
7.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,培养所述重组人参细胞的方法包括将重组人参细胞分散于液体改良MS培养基中悬浮培养,所述液体改良MS培养基中添加有新霉素及潮霉素B,筛选获得阳性表达的重组人参细胞,并继续传代培养。
8.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述提取其外泌体的方法包括:先收集重组人参细胞的培养上清或者细胞裂解物上清,随后从培养上清或细胞裂解物上清中提取分离外泌体;收集细胞裂解物上清的方法包括将培养后的重组人参细胞进行超声辅助细胞破碎、反复冻融或均质后收集上清;所述提取分离外泌体的方法包括超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、磁珠免疫分离法、尺寸排阻法或阳离子聚合物沉淀法。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述提取其外泌体的方法包括:收集重组人参细胞的培养上清,2000×g离心20 min,6000×g离心30 min,循环2次,去除沉淀收集上清;将去除沉淀后收集的上清100000×g离心30 min,收集沉淀并用缓冲液重悬,得到外泌体。
10.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述人参细胞的制备方法包括将生人参洗净后,切成小块,接种于半固体改良MS培养基中,黑暗条件培养数天后将愈伤组织继代培养后,将愈伤组织分散于液体改良MS培养基中悬浮培养,过滤悬浮培养液,得到单个人参细胞。
11.权利要求1-3任一所述的人参细胞工程化肿瘤疫苗或权利要求4-10任一所述的制备方法制得的人参细胞工程化肿瘤疫苗在肿瘤疾病预防、治疗药物或者抑制肿瘤复发或转移药物的制备中的应用;所述肿瘤为黑色素瘤、结直肠肿瘤、乳腺肿瘤或淋巴细胞瘤。
12.根据权利要求1-3任一所述的人参细胞工程化肿瘤疫苗,其特征在于,人参细胞工程化肿瘤疫苗的给药方法包括皮下接种、皮内注射、肌肉注射、口服给予、淋巴结内注射;还包括将肿瘤疫苗体外激活患者骨髓来源树突状细胞后,向淋巴结内、静脉、肌肉、皮下或皮内注射激活后的树突状细胞。