有效
一种生产5-碳化合物或其聚合物的方法
陈国强、杨芳、刘絮、王欢
清华大学
摘要
本发明提供了一种生产5‑碳化合物或其聚合物的重组菌及其应用,通过对原本不能生产5‑碳化合物的菌株进行改造,加入5‑碳化合物合成基因,构建可以生产5‑碳化合物或包含5‑碳化合物单体的聚合物的重组菌,实现5‑氨基戊酸、5‑羟基戊酸、5‑羟基戊酸相关的PHA等高附加值化合物的生产。以搭建一个更加经济、可持续和高效益生产5‑碳化合物、包含5‑碳化合物单体的聚合物的平台,对进一步降低生产成本,提高可持续发展方面具有重要的作用。
1.一种生产5-碳化合物的重组菌,其特征在于,所述的重组菌为发酵产生PHA的盐单胞菌,所述的重组菌的基因组中缺失 gabD 2 和 gabD 3 ,所述的重组菌的基因组中包含5-碳化合物的合成基因,所述5-碳化合物的合成基因为A)L-赖氨酸单氧酶编码基因和5-氨基戊酰胺酶编码基因;和/或,B)乙醇脱氢酶编码基因,所述的5-碳化合物包括5-氨基戊酸或5-羟基戊酸,其中,所述的L-赖氨酸单氧酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO:1,所述的5-氨基戊酰胺酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO:2,所述的乙醇脱氢酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO:3。
2.根据权利要求1所述的重组菌,其特征在于,所述的盐单胞菌包括 Halomonas bluephagenesis 、 Halomonas campaniensis 或 Halomonas aydingkolgenesis 。
3.根据权利要求1所述的重组菌,其特征在于,所述的重组菌缺失 gabT 1 和/或 gabT 2 。
4.根据权利要求1所述的重组菌,其特征在于,所述的重组菌包含L-赖氨酸至5氨基戊酸途径;所述的重组菌包括:A)缺失 gabD 2 和 gabD 3 ,且,所述5-碳化合物的合成基因包含L-赖氨酸单氧酶编码基因和5-氨基戊酰胺酶编码基因;或,B)缺失 gabD 2 、 gabD 3 、 gabT 1 和 gabT 2 ,且,所述5-碳化合物的合成基因包含L-赖氨酸单氧酶编码基因和5-氨基戊酰胺酶编码基因。
5.根据权利要求1所述的重组菌,其特征在于,所述的重组菌包含5-氨基戊酸至5-羟基戊酸途径,所述的重组菌包括缺失 gabD 2 和 gabD 3 ,且,所述5-碳化合物的合成基因包含乙醇脱氢酶编码基因。
6.根据权利要求1所述的重组菌,其特征在于,所述的重组菌包含L-赖氨酸至5羟基戊酸途径;所述的重组菌包括缺失 gabD 2 和 gabD 3 ,且,所述5-碳化合物的合成基因包含L-赖氨酸单氧酶编码基因、5-氨基戊酰胺酶编码基因和乙醇脱氢酶编码基因。
7.根据权利要求1-6任一所述的重组菌,其特征在于,所述的 L-赖氨酸单氧酶编码基因和5-氨基戊酰胺酶编码基因来源于恶臭假单胞菌( Pseudomonas putida )。
8.根据权利要求1-6任一所述的重组菌,其特征在于,所述的乙醇脱氢酶编码基因来源于盐单胞菌( Halomonas )或大肠杆菌( Escherichia coli )。
9.根据权利要求1所述的重组菌,其特征在于,所述的5-碳化合物的合成基因由启动子调控表达,所述的启动子为组成型和/或诱导型。
10.根据权利要求9所述的重组菌,其特征在于,所述的组成型启动子包括 P porin 、 P porin29 、P porin88 、P porin221 、P porin194 、P porin251 、P porin278 、P porin68 、P porin42 、P porin58 、P porin226 、P porin183 、 P porin140 或 P porin141 ;所述的诱导型启动子包括P tac 启动子、P lux 启动子或P lac 启动子,调控所述诱导型启动子的诱导剂包括IPTG或者AHL。
11.一种生产包含5-碳化合物单体的聚合物的重组菌,其特征在于,所述的重组菌为发酵产生PHA的盐单胞菌,所述的重组菌的基因组包括PHA合成酶编码基因和5-羟基戊酸辅酶A转移酶编码基因,所述的5-碳化合物单体的聚合物包括聚3-羟基丁酸-5-羟基戊酸共聚酯,其中,所述的PHA合成酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO:4,所述的5-羟基戊酸辅酶A转移酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO:5。
12.根据权利要求11所述的重组菌,其特征在于,所述的盐单胞菌包括 Halomonas bluephagenesis 、 Halomonas campaniensis 或 Halomonas aydingkolgenesis 。
13.根据权利要求11所述的重组菌,其特征在于,所述的PHA合成酶编码基因来源于豚鼠气单胞菌FA440( Aeromonas caviae FA440)或富养罗尔斯通氏菌( Ralstonia eutropha )。
14.根据权利要求11所述的重组菌,其特征在于,所述的5-羟基戊酸辅酶A转移酶编码基因来源于大肠杆菌( Escherichia coli) 。
15.根据权利要求11所述的重组菌,其特征在于,所述的重组菌为权利要求1-10任一所述的重组菌的基础上进一步导入PHA合成酶编码基因和5-羟基戊酸辅酶A转移酶编码基因。
16.根据权利要求11所述的重组菌,其特征在于,所述的重组菌包括L-赖氨酸的底物至包含5-羟基戊酸单体的PHA途径,所述的重组菌为权利要求1-3或6-10任一所述的重组菌的基础上进一步导入PHA合成酶编码基因和5-羟基戊酸辅酶A转移酶编码基因。
17.根据权利要求11所述的重组菌,其特征在于,所述的重组菌包括5-氨基戊酸的底物至包含5-羟基戊酸单体的PHA途径,所述的重组菌为权利要求1-3、5或7-10任一所述的重组菌的基础上进一步导入PHA合成酶编码基因和5-羟基戊酸辅酶A转移酶编码基因。
18.根据权利要求16或17所述的重组菌,其特征在于,所述的重组菌包括进一步导入L-赖氨酸单氧酶编码基因和5-氨基戊酰胺酶编码基因。
19.一种生产5-碳化合物或包含5-碳化合物单体的聚合物的方法,其特征在于,所述的方法包括培养权利要求1-18任一所述的重组菌,所述的5-碳化合物包括5-氨基戊酸或5-羟基戊酸,所述的5-碳化合物单体的聚合物包括聚3-羟基丁酸-5-羟基戊酸共聚酯。
20.根据权利要求19所述的方法,其特征在于,所述培养使用的培养基中包含碳源和/或氮源。
21.根据权利要求20所述的方法,其特征在于,所述的碳源包括葡萄糖或能够分解为葡萄糖的糖、脂肪或蛋白质;或者,L-赖氨酸或能够分解为L-赖氨酸的蛋白质。
22.根据权利要求20所述的方法,其特征在于,所述的氮源包含无机氮源和/或有机氮源;所述的无机氮源包括硫酸铵、硝酸盐、氨水或尿素的一种或两种以上的组合;所述的有机氮源包括黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母提取物或鱼粉的一种或两种以上的组合。
23.根据权利要求20所述的方法,其特征在于,所述的培养基包括尿素和/或酵母提取物,培养基中尿素浓度为0.5 g/L-2 g/L,酵母提取物浓度为0.5 g/L-2 g/L。
24.一种权利要求1-18任一所述的重组菌或权利要求19-23任一所述的方法在制备可降解的生物新材料或药物中的应用。



