一种在微生物中调控多基因表达的方法及其应用

1.一种调控多基因表达的微生物，其特征在于，所述的微生物包括将编码调控蛋白的核苷酸序列插入微生物基因组中，所述的微生物包括表达载体，所述的表达载体包含与对应的调控蛋白作用的启动子以及产物合成基因，所述的与对应的调控蛋白作用的启动子为诱导型启动子，所述的诱导型启动子包含调控蛋白的结合位点，所述的调控蛋白选自AraC、CinR、CymR、NahR、VanR、TetR、LuxR、TtgR或PhlF中的一种或两种以上，所述的微生物选自罗氏真养杆菌（ Ralstonia eutropha ）、假单胞菌属（ Pseudomonas ）或嗜盐单胞菌属（ Halomonas ），所述的假单胞菌属（ Pseudomonas ）为 Pseudomonas entomophila ，所述的诱导型启动子选自带有调控蛋白AraC结合位点的启动子P BAD_NNNN 、带有调控蛋白CinR结合位点的启动子P Cin_NNNN 、带有调控蛋白CymR结合位点的启动子P Cym_NNNN 、带有调控蛋白NahR结合位点的启动子P Sal_NNNN 、带有调控蛋白VanR结合位点的启动子P Van_NNNN 、带有调控蛋白TetR结合位点的启动子P Tet_NNNN 、带有调控蛋白LuxR结合位点的启动子P Lux_NNNN 、带有调控蛋白TtgR结合位点的启动子P Ttg_NNNN 、带有调控蛋白PhlF结合位点的启动子P PhlF_NNNN 中的一种或两种以上，所述的启动子P BAD_NNNN 的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示，其中，NNNN为ACAC、TTGC、GGCG或ACTC；或，所述的启动子P Cin_NNNN 的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示，其中，NNNN为GAAC或GCCC；或，所述的启动子P Cym_NNNN 的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示，其中，NNNN为GCTG、AGGA或TCTG；或，所述的启动子P Sal_NNNN 的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；或，所述的启动子P Van_NNNN 的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；或，所述的启动子P Tet_NNNN 的核苷酸序列如SEQID No.16所示；或，所述的启动子P Lux_NNNN 的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示，其中，NNNN为CTGT、GGTG或TTGT；或，所述的启动子P Ttg_NNNN 的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；或，所述的启动子P PhlF_NNNN 的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示，所述的诱导型启动子包括以下启动子中的至少一种：P BAD_NNNN ，NNNN为ACAC、TTGC或GGCG；P Cin_NNNN ，NNNN为GCCC；P Cym_NNNN ，NNNN为GCTG或AGGA；P Lux_NNNN ，NNNN为CTGT或GGTG；所述的调控蛋白AraC的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述的调控蛋白CinR的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述的调控蛋白CymR的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述的调控蛋白NahR的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；所述的调控蛋白VanR的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；所述的调控蛋白TetR的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述的调控蛋白LuxR的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；所述的调控蛋白TtgR的氨基酸序列如SEQ IDNo.8所示；所述的调控蛋白PhlF的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。 2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述的嗜盐单胞菌属（ Halomonas ）包括 Halomonas bluephagenesis 、 Halomonas campaniensis 和 Halomonas aydingkolgenesis 中的任一种。 3.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述的产物包含胞内产物、分泌到胞外的酶、与细胞形态相关的蛋白或与细胞内基因调控相关的蛋白或RNA。 4.根据权利要求3所述的微生物，其特征在于，所述的产物包含PHA、四氢嘧啶、氨基酸、肌醇、1,3-丙二醇、3-羟基丙酸、1，5-戊二胺、5-氨基乙酰丙酸、脂肪酶、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、酯酶、葡聚糖酶、果胶酶、磷酯酶、明胶酶、核酸酶、微管蛋白FtsZ、细胞骨架蛋白MreB、细胞分裂调控因子MinCD、乳糖操纵子遏制蛋白LacI、四环素操纵子阻遏蛋白TetR或番茄红素中的一种或两种以上。 5.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述的产物合成基因包含 dxs ， crtE 、 crtI 、 crtB 、 idi 、 dxs 、 phaA 、 phaB 、 phaC 、 ectA 、 ectB 、 ectC 、 gdh 、 argJ 、 argB 、 argC 、 argD 、 argF 、 argG 、 argH 和 pgl 中的一种或两种以上。 6.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述的微生物在培养过程中加入诱导剂，所述的诱导剂包括阿拉伯糖、OHC14、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、OC6、柚皮素和DAPG中的一种或两种以上。 7.根据权利要求1-6任一所述的微生物，其特征在于，所述调控多基因表达使用多种诱导表达系统，所述的诱导表达系统包括诱导剂、调控蛋白和与调控蛋白作用的启动子。 8.根据权利要求7所述的微生物，其特征在于，阿拉伯糖诱导表达系统包括诱导剂阿拉伯糖、调控蛋白AraC和与调控蛋白作用的启动子P BAD_NNNN 。 9.根据权利要求7所述的微生物，其特征在于，OHC14诱导表达系统表达系统包括诱导剂OHC14、调控蛋白CinR和与调控蛋白作用的启动子P Cin_NNNN 。 10.根据权利要求7所述的微生物，其特征在于，枯茗酸诱导表达系统表达系统包括诱导剂枯茗酸、调控蛋白CymR和与调控蛋白作用的启动子P Cym_NNNN 。 11.根据权利要求7所述的微生物，其特征在于，水杨酸钠诱导表达系统表达系统包括诱导剂水杨酸钠、调控蛋白NahR和与调控蛋白作用的启动子P Sal_NNNN 。 12.根据权利要求7所述的微生物，其特征在于，香草酸诱导表达系统表达系统包括诱导剂香草酸、调控蛋白VanR和与调控蛋白作用的启动子P Van_NNNN 。 13.根据权利要求7所述的微生物，其特征在于，无水四环素诱导表达系统表达系统包括诱导剂无水四环素、调控蛋白TetR和与调控蛋白作用的启动子P Tet_NNNN 。 14.根据权利要求7所述的微生物，其特征在于，OC6诱导表达系统表达系统包括诱导剂OC6、调控蛋白LuxR和与调控蛋白作用的启动子P Lux_NNNN 。 15.根据权利要求7所述的微生物，其特征在于，柚皮素诱导表达系统表达系统包括诱导剂柚皮素、调控蛋白TtgR和与调控蛋白作用的启动子P Ttg_NNNN 。 16.根据权利要求7所述的微生物，其特征在于，DAPG诱导表达系统表达系统包括诱导剂DAPG、调控蛋白PhlF和与调控蛋白作用的启动子P PhlF_NNNN 。 17.根据权利要求8-16任一所述的微生物，其特征在于，所述的诱导表达系统包括以下组合：1）香草酸、OC6、OHC14、阿拉伯糖和水杨酸钠诱导表达系统；2）无水四环素、枯茗酸和DAPG诱导表达系统；3）柚皮素、阿拉伯糖和OHC14诱导表达系统；4）阿拉伯糖、OHC14、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、OC6、柚皮素和DAPG诱导表达系统；或，5）水杨酸钠、OHC14和阿拉伯糖诱导表达系统。 18.一种在微生物中调控多基因表达的方法，其特征在于，所述的方法包括培养权利要求1-17任一所述的微生物。 19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括加入诱导剂，所述的诱导剂包括阿拉伯糖、OHC14、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、OC6、柚皮素和DAPG中的一种或两种以上。 20.根据权利要求18-19任一所述的方法，其特征在于，所述调控多基因表达使用多种诱导表达系统，所述的诱导表达系统包括诱导剂、调控蛋白和与调控蛋白作用的启动子。 21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，阿拉伯糖诱导表达系统包括诱导剂阿拉伯糖、调控蛋白AraC和与调控蛋白作用的启动子P BAD_NNNN 。 22.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，OHC14诱导表达系统表达系统包括诱导剂OHC14、调控蛋白CinR和与调控蛋白作用的启动子P Cin_NNNN 。 23.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，枯茗酸诱导表达系统表达系统包括诱导剂枯茗酸、调控蛋白CymR和与调控蛋白作用的启动子P Cym_NNNN 。 24.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，水杨酸钠诱导表达系统表达系统包括诱导剂水杨酸钠、调控蛋白NahR和与调控蛋白作用的启动子P Sal_NNNN 。 25.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，香草酸诱导表达系统表达系统包括诱导剂香草酸、调控蛋白VanR和与调控蛋白作用的启动子P Van_NNNN 。 26.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，无水四环素诱导表达系统表达系统包括诱导剂无水四环素、调控蛋白TetR和与调控蛋白作用的启动子P Tet_NNNN 。 27.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，OC6诱导表达系统表达系统包括诱导剂OC6、调控蛋白LuxR和与调控蛋白作用的启动子P Lux_NNNN 。 28.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，柚皮素诱导表达系统表达系统包括诱导剂柚皮素、调控蛋白TtgR和与调控蛋白作用的启动子P Ttg_NNNN 。 29.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，DAPG诱导表达系统表达系统包括诱导剂DAPG、调控蛋白PhlF和与调控蛋白作用的启动子P PhlF_NNNN 。 30.根据权利要求21-29任一所述的方法，其特征在于，所述的诱导表达系统包括以下组合：1）香草酸、OC6、OHC14、阿拉伯糖和水杨酸钠诱导表达系统；2）无水四环素、枯茗酸和DAPG诱导表达系统；3）柚皮素、阿拉伯糖和OHC14诱导表达系统；4）阿拉伯糖、OHC14、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、OC6、柚皮素和DAPG诱导表达系统；或，5）水杨酸钠、OHC14和阿拉伯糖诱导表达系统。 31.一种生产产物的方法，其特征在于，所述的方法包括培养权利要求1-16任一所述的微生物。 32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括加入诱导剂，所述的诱导剂包括阿拉伯糖、OHC14、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、OC6、柚皮素和DAPG中的一种或两种以上。 33.根据权利要求31-32任一所述的方法，其特征在于，所述调控多基因表达使用多种诱导表达系统，所述的诱导表达系统包括诱导剂、调控蛋白和与调控蛋白作用的启动子。 34.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，阿拉伯糖诱导表达系统包括诱导剂阿拉伯糖、调控蛋白AraC和与调控蛋白作用的启动子P BAD_NNNN 。 35.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，OHC14诱导表达系统表达系统包括诱导剂OHC14、调控蛋白CinR和与调控蛋白作用的启动子P Cin_NNNN 。 36.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，枯茗酸诱导表达系统表达系统包括诱导剂枯茗酸、调控蛋白CymR和与调控蛋白作用的启动子P Cym_NNNN 。 37.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，水杨酸钠诱导表达系统表达系统包括诱导剂水杨酸钠、调控蛋白NahR和与调控蛋白作用的启动子P Sal_NNNN 。 38.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，香草酸诱导表达系统表达系统包括诱导剂香草酸、调控蛋白VanR和与调控蛋白作用的启动子P Van_NNNN 。 39.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，无水四环素诱导表达系统表达系统包括诱导剂无水四环素、调控蛋白TetR和与调控蛋白作用的启动子P Tet_NNNN 。 40.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，OC6诱导表达系统表达系统包括诱导剂OC6、调控蛋白LuxR和与调控蛋白作用的启动子P Lux_NNNN 。 41.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，柚皮素诱导表达系统表达系统包括诱导剂柚皮素、调控蛋白TtgR和与调控蛋白作用的启动子P Ttg_NNNN 。 42.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，DAPG诱导表达系统表达系统包括诱导剂DAPG、调控蛋白PhlF和与调控蛋白作用的启动子P PhlF_NNNN 。 43.根据权利要求34-42任一所述的方法，其特征在于，所述的诱导表达系统包括以下组合：1）香草酸、OC6、OHC14、阿拉伯糖和水杨酸钠诱导表达系统；2）无水四环素、枯茗酸和DAPG诱导表达系统；3）柚皮素、阿拉伯糖和OHC14诱导表达系统；4）阿拉伯糖、OHC14、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、OC6、柚皮素和DAPG诱导表达系统；或，5）水杨酸钠、OHC14和阿拉伯糖诱导表达系统。 44.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述的产物包含胞内产物、分泌到胞外的酶、与细胞形态相关的蛋白或与细胞内基因调控相关的蛋白或RNA。 45.根据权利要求44所述的方法，其特征在于，所述的产物包含PHA、四氢嘧啶、氨基酸、肌醇、1,3-丙二醇、3-羟基丙酸、1，5-戊二胺、5-氨基乙酰丙酸、脂肪酶、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、酯酶、葡聚糖酶、果胶酶、磷酯酶、明胶酶、核酸酶、微管蛋白FtsZ、细胞骨架蛋白MreB、细胞分裂调控因子MinCD、乳糖操纵子遏制蛋白LacI、四环素操纵子阻遏蛋白TetR或番茄红素中的一种或两种以上。 46.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述的产物为PHA，所述的微生物为向将阿拉伯糖转运蛋白编码基因 araE 、阿拉伯糖诱导表达系统的调控蛋白编码基因 araC 、OHC14诱导表达系统的调控蛋白编码基因 cinR 、枯茗酸诱导表达系统的调控蛋白编码基因 cymR 、水杨酸钠诱导表达系统的调控蛋白编码基因 nahR 、香草酸诱导表达系统的调控蛋白编码基因 vanR 、无水四环素诱导表达系统的调控蛋白编码基因 tetR 、OC6诱导表达系统的调控蛋白编码基因 luxR 、柚皮素诱导表达系统的调控蛋白编码基因 ttgR 和DAPG诱导表达系统的调控蛋白编码基因 phlF 插入 H. campaniensis LS21或 P. entomophila LAC32基因组后获得的菌株中导入包含 phaA 、 phaB 和 phaC 基因的所述表达载体。 47.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，所述的方法包括使用水杨酸钠、OHC14和阿拉伯糖诱导表达系统，或者，无水四环素、枯茗酸和DAPG诱导表达系统。 48.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述的产物为番茄红素，所述的微生物为向将阿拉伯糖转运蛋白编码基因 araE 、阿拉伯糖诱导表达系统的调控蛋白编码基因 araC 、OHC14诱导表达系统的调控蛋白编码基因 cinR 、枯茗酸诱导表达系统的调控蛋白编码基因 cymR 、水杨酸钠诱导表达系统的调控蛋白编码基因 nahR 、香草酸诱导表达系统的调控蛋白编码基因 vanR 、无水四环素诱导表达系统的调控蛋白编码基因 tetR 、OC6诱导表达系统的调控蛋白编码基因 luxR 、柚皮素诱导表达系统的调控蛋白编码基因 ttgR 和DAPG诱导表达系统的调控蛋白编码基因 phlF 插入 H. bluephagenesis TD01基因组后获得的菌株中导入包含 crtE 、 crtI 、 crtB 、 idi 和 dxs 基因的所述表达载体。 49.根据权利要求48所述的方法，其特征在于，所述的方法包括使用香草酸、OC6、OHC14、阿拉伯糖和水杨酸钠诱导表达系统。 50.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述的产物为四氢嘧啶，所述的微生物为向将阿拉伯糖转运蛋白编码基因 araE 、阿拉伯糖诱导表达系统的调控蛋白编码基因 araC 、OHC14诱导表达系统的调控蛋白编码基因 cinR 、枯茗酸诱导表达系统的调控蛋白编码基因 cymR 、水杨酸钠诱导表达系统的调控蛋白编码基因 nahR 、香草酸诱导表达系统的调控蛋白编码基因 vanR 、无水四环素诱导表达系统的调控蛋白编码基因 tetR 、OC6诱导表达系统的调控蛋白编码基因 luxR 、柚皮素诱导表达系统的调控蛋白编码基因 ttgR 和DAPG诱导表达系统的调控蛋白编码基因 phlF 插入 H. aydingkolgenesis M1基因组后获得的菌株中导入包含 ectA 、 ectB 和 ectC 基因的所述表达载体。 51.根据权利要求50所述的方法，其特征在于，所述的方法包括使用柚皮素、阿拉伯糖和OHC14诱导表达系统。 52.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述的产物为精氨酸，所述的微生物为向将阿拉伯糖转运蛋白编码基因 araE 、阿拉伯糖诱导表达系统的调控蛋白编码基因 araC 、OHC14诱导表达系统的调控蛋白编码基因 cinR 、枯茗酸诱导表达系统的调控蛋白编码基因 cymR 、水杨酸钠诱导表达系统的调控蛋白编码基因 nahR 、香草酸诱导表达系统的调控蛋白编码基因 vanR 、无水四环素诱导表达系统的调控蛋白编码基因 tetR 、OC6诱导表达系统的调控蛋白编码基因 luxR 、柚皮素诱导表达系统的调控蛋白编码基因 ttgR 和DAPG诱导表达系统的调控蛋白编码基因 phlF 插入 R. eutropha H16基因组后获得的菌株中导入包含 gdh 、 argJ 、 argB 、 argC 、 argD 、 argF 、 argG 、 argH 和 pgl 基因的上述表达载体。 53.根据权利要求52所述的方法，其特征在于，所述的方法包括使用阿拉伯糖、OHC14、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、OC6、柚皮素、DAPG诱导表达系统。 54.一种启动子，其特征在于，所述的启动子与对应的调控蛋白作用，所述的启动子为诱导型启动子，所述的启动子包含对应的调控蛋白的结合位点，所述的调控蛋白选自AraC、CinR、CymR或LuxR中的一种或两种以上，所述的诱导型启动子选自带有调控蛋白AraC结合位点的启动子P BAD_NNNN 、带有调控蛋白CinR结合位点的启动子P Cin_NNNN 、带有调控蛋白CymR结合位点的启动子P Cym_NNNN 、带有调控蛋白LuxR结合位点的启动子P Lux_NNNN 中的一种或两种以上，所述的启动子P BAD_NNNN 的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示，其中，NNNN为ACAC、TTGC、GGCG、AGAG或GCTT；所述的启动子P Cin_NNNN 的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示，其中，NNNN为GCCC、GGGG、TGGG、TCAT或TTAA；所述的启动子P Cym_NNNN 的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示，其中，NNNN为GCTG、AGGA、GAGA、CCGG或CCAC；所述的启动子P Lux_NNNN 的核苷酸序列如SEQ IDNo.26所示，其中，NNNN为CTGT、GGTG、GTGG、ATGT或CATG。 55.根据权利要求54所述的启动子，其特征在于，所述的启动子包括SEQ ID No.29、31-37任一所示核苷酸序列。 56.一种表达载体或细胞，其特征在于，所述的表达载体或细胞包含权利要求53-54任一所述的启动子。 57.权利要求1-17任一所述的的微生物、权利要求18-53任一所述的方法、权利要求54-55任一所述的启动子和/或权利要求56所述的表达载体或细胞在基因编辑或产物合成中的应用。