将干细胞诱导为肝细胞的方法和试剂盒

1.一种试剂盒，其化学成分明确，包括：第一培养基，用于将干细胞诱导为表达内胚层谱系特征性标志物的细胞，所述第一培养基中含有B27、2-4μM肝糖原合成激酶3β和50-500ng/mL ActivinA；第二培养基，用于将表达内胚层谱系特征性标志物的细胞诱导为肝祖细胞，所述第二培养基中含有10-100μg/L维生素C磷酸酯盐、1-50μg/L胰岛素、1-20mg/mL转铁蛋白、0.1-1ng/mL亚硒酸盐、NEAA、GlutaMax和体积含量为0.5％-5％的DMSO；和第三培养基，用于将肝祖细胞诱导为表达肝谱系特征性标志物的细胞，所述第三培养基中含有1-5μM TGF-β受体抑制剂、0.5-5μMNOTCH信号通路抑制剂、10-50ng/mL抑瘤素OSM、10-50ng/mL肝细胞生长因子HGF和5-50μM地塞米松DXM。 2.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于下述的一项或多项：(1)所述维生素C磷酸酯盐选自维生素C磷酸酯镁、维生素C磷酸酯钠和维生素C磷酸酯钙；(2)所述维生素C磷酸酯盐的浓度为10、20、30、40、50、60、70、80、90或100μg/L；(3)所述胰岛素的浓度为1、5、10、20、30、40或50μg/L；(4)所述转铁蛋白的浓度为1、5、10或20mg/mL；(5)所述亚硒酸盐为亚硒酸钠；(6)所述亚硒酸盐的浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1ng/mL。 3.权利要求1所述的试剂盒，所述DMSO的体积含量为0.5％、1％、2％、3％、4％或5％。 4.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于下述的一项或多项：(1)所述肝糖原合成激酶3β为CHIR99021；(2)所述肝糖原合成激酶3β的浓度为2、3或4μM；(3)所述ActivinA的浓度为50、100、200、300、400或500ng/mL。 5.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于下述的一项或多项：(1)所述TGF-β受体抑制剂为SB431542；(2)所述TGF-β受体抑制剂添加量为1、2、3、4或5μM；(3)所述NOTCH信号通路抑制剂为RO4929097；(4)所述NOTCH信号通路抑制剂添加量为0.5、1、2、3、4或5μM(5)所述OSM的浓度为10、20、30、40或50ng/mL；(6)所述HGF的浓度为10、20、30、40或50ng/mL；(7)所述DXM的浓度为5、10、20、30、40或50μM。 6.权利要求1所述的试剂盒，其中所述第一培养基、第二培养基和第三培养基各自独立地包括下述基础培养基：RPMI、DMEM/F12和IMDM。 7.权利要求1所述的试剂盒，其中所述干细胞为诱导的多能干细胞或人胚胎干细胞系。 8.权利要求1-7任一项的试剂盒，其特征在于下述的一项或多项：(1)所述内胚层谱系特征性标志物选自FOXA2、SOX17、CXCR4、GATA4和Mixl1中的一种或多种；(2)所述肝祖细胞为表达肝祖细胞谱系特征性标志物的细胞，所述肝祖细胞谱系特征性标志物选自AFP、TBX3、PROX1、白蛋白、c-MET、HNF1B、HNF4α、HNF6、CEBPα中的一种或多种；(3)所述肝谱系特征性标志物选自ALB、AAT、FAH、TAT、HGD、PAH、ARG1、CPS1、CK18和ASGPR1中的一种或多种。 9.一种体外诱导干细胞分化为表达肝谱系特征性标志物的细胞的方法，其包括以下步骤：(1)将干细胞在含肝糖原合成激酶3β的第一培养基中培养1天，随后在不含肝糖原合成激酶3β的第一培养基中继续培养2天得到表达内胚层谱系特征性标志物的细胞；(2)将表达内胚层谱系特征性标志物的细胞在第二培养基中培养6天得到肝祖细胞；(3)将肝祖细胞在第三培养基中培养10天得到所述表达肝谱系特征性标志物的细胞；其中，所述第一培养基、第二培养基和第三培养基如权利要求1-8中任一项所定义。 10.权利要求9所述的方法，其中，在步骤(1)之前，还包括将所述干细胞扩大培养的步骤。 11.权利要求10所述的方法，所述扩大培养包括以下步骤：将所述干细胞消化成单细胞，而后在添加了ROCK抑制剂的无血清培养基中重悬，以1～2×10 4 /cm 2 的密度将所得干细胞悬液接种至无血清培养基中，培养1-2天。 12.权利要求11所述的方法，其中所述ROCK抑制剂为Y27632。 13.权利要求11所述的方法，其中所述无血清培养基为E8培养基。