1.基于TCV的同时沉默2个内源基因的VIGS载体,其特征在于,所述2个基因,其中一个为内源基因PDS,另一个为内源基因“X基因”,该VIGS载体用于植物中基因沉默;该VIGS载体通过如下步骤构建获得:(一)利用人工合成片段构建基于TCV高效沉默PDS基因的病毒诱导沉默载体CPB1B(1)靶标PDS的基因片段设计和合成首先,确定产生的siRNA序列如SEQ ID NO.1所示,具体为:5’-AAGATGGTTTATCAGTCAAAG-3’;然后,人工合成包含该序列的44 bp的PDS基因片段PDS1-F,另外合成在3’端添加碱基“TAC”的反向互补序列PDS1-R(TAC);最终合成序列分别为:PDS1-F:5’-CAAGATGGTTTATCAGTCAAAGAATGGATGGAAAAGCAGGGAGTAC-3’,PDS1-R(TAC):5’-TCCCTGCTTTTCCATCCATTCTTTGACTGATAAACCATCTTGGTAC-3’;(2)构建病毒诱导沉默载体CPB1B首先,将人工合成片段PDS1-F和PDS1-R(TAC)等量混合后,进行变性、退火处理;其次,对病毒沉默功能抑制子功能减弱的TCV病毒载体CPB-CC进行Kpn I单酶切,凝胶回收线性化产物并进行去磷酸化处理;第三,将回收的磷酸化处理产物与经变性、退火的人工合成片段PDS1-F和PDS1-R(TAC)的混合物,进行连接;第四,将连接产物转入感受态细胞后,随机选取Amp + 的LB平板上形态正常的菌落进行质粒提取,酶切鉴定的阳性克隆再进行测序鉴定,确保重组正确,最终获得仅保留一个Kpn I酶切位点的VIGS载体CPB1B备用;(二)构建基于TCV高效沉默目标基因“X基因”和PDS的VIGS载体CPB1B-X(1)靶标基因的基因沉默序列选择及引物设计首先,对内源靶标基因“X基因”序列进行分析,确定产生siRNA的序列作为靶向序列;其次,设计扩增靶向序列的正反向引物;设计引物时,在正反向引物设计中分别添加病毒载体CPB1B酶切位点Kpn I两侧的序列的部分序列“5’-TTGACTGATAAACCATCTTGGTAC-3’”和5’端的部分序列“5’-CTAAGATGAGAAGACTACACTATG-3’”;(2)扩增靶标基因序列制备PCR扩增用模板,利用步骤(1)中所设计引物进行PCR扩增; PCR产物经电泳鉴定后,对目的片段进行纯化回收;(3)构建同时沉默2个内源基因的VIGS病毒载体CPB1B-X首先,用Kpn I对步骤(一)中所构建的病毒载体CPB1B进行单酶切,回收线性化酶切产物;其次,将上述回收的CPB1B的线性化酶切产物与步骤(2)中扩增的内源靶标基因序列进行连接;最后,将连接产物转入感受态细胞后,进行筛选、鉴定,构建获得可同时沉默2个基因的VIGS病毒载体CPB1B-X。
2.如权利要求1所述基于TCV的同时沉默2个内源基因的VIGS载体,其特征在于,所述内源基因“X基因”为DRB2基因。
3.如权利要求2所述基于TCV的同时沉默2个内源基因的VIGS载体,其特征在于,针对内源基因DRB2基因,步骤(二)的步骤(1)中,确定产生siRNA的序列为DRB2A序列或DRB2B序列;DRB2A序列如SEQ ID NO.2所示,具体为:TTTCCAAGGCTGCTGCCATAATTCTGTCAATACCGGAAGTTGCTGCTAAGGATGATCTGCTGCTTCTGGAAGGTTGTTTTGGGCAAATAAAGGGTAAGATTC;DRB2B序列如SEQ ID NO.3所示,具体为:GTTGTTTTGGGCAAATAAAGGGTAAGATTCTCGATGTGGTTGCAGGAGAAGGCTGTGGACTTGTTGGTCTAAGGTTCTGCATAAAGAACTTCTTTGCAAA。
4.如权利要求3所述基于TCV的同时沉默2个内源基因的VIGS载体,其特征在于,针对DRB2A序列和DRB2B序列,步骤(二)的步骤(1)中,引物序列设计为:G-CPB1B-DRB2AF:5’-TTGACTGATAAACCATCTTGGTACTTTCCAAGGCTGCTGCCATAATTC-3’,G-CPB1B-DRB2AR:5’-CTAAGATGAGAAGACTACACTATGGAATCTTACCCTTTATTTGCCCA-3’;G-CPB1B-DRB2BF:5’-TTGACTGATAAACCATCTTGGTACGTTGTTTTGGGCAAATAAAGGGT-3’,G-CPB1B-DRB2BR:5’-CTAAGATGAGAAGACTACACTATGTTTGCAAAGAAGTTCTTTATGCAG-3’。
5.如权利要求1所述基于TCV的同时沉默2个内源基因的VIGS载体,其特征在于,该VIGS载体用于拟南芥中2个内源基因沉默。