近年来，利用荧光传感技术多目标物同时响应的探针被不断开发用于细胞代谢过程的原位、实时监测。为了避免多目标物同时监测过程中荧光通道的相互干扰，现阶段的探针几乎都缺乏比率的能力，导致其示踪代谢过程的准确性大打折扣，尤其是在代谢发生起点的判断能力明显不足。
近期，陕西科技大学强涛涛教授团队联合英国巴斯大学James. Tony D.教授团队和中南民族大学李春涯教授团队，利用跨键能量转移（TBET）机制设计了粘性和过氧亚硝酸根（ONOO−）双功能线粒体靶向双光子比率探针Mito-ONOO，不仅实现了双发射峰的基线分离，以提高生物成像的分辨率和可靠性，而且首次实现了通过比率分析在OGD/R过程中对自噬和氧化应激的代谢过程进行了实时可视化。研究显示在细胞氧糖剥夺并在进行复氧糖过程细胞随即产生ONOO−并导致细胞氧化应激的发生，在15 min后及有明显的细胞自噬的发生，该结果有潜力为脑卒中的诊断、治疗及药物设计提供新的靶点。（如图1所示）。
图1 探针Mito-ONOO设计及识别机理示意图
为了实现脑卒中过程中氧化应激和细胞自噬代谢的精准实时监测，探针需要具备线粒体的精准锚定能力，并且需要同时对细胞活性氧和粘度具备高保真和快速响应的能力。本工作首先利用筛选的策略，获得了具有线粒体靶向能力、ONOO−特异性响应和超快反应速率的近红外染料A-ONOO，与具有高化学稳定性的双光子荧光团香豆素通过炔键连接，构建跨键能量转移（TBET）体系（Mito-ONOO），如图二所示。同时探针的水溶液实现表明探针具有环境粘性和ONOO−双功能响应能力，同时兼具良好的水分散性、双发射峰无干扰的比率信号、良好的稳定性和选择性以及快速响应能力。细胞实验表明探针不仅具有良好的生物相容性，同时具有线粒体靶向以及细胞自噬和氧化应激同时可视化原位分析。
图2 ICT-TBET平台性能研究
接下来，本工作构建了氧糖剥夺（OGD）模型，并且利用探针Mito-ONOO实时追踪了在复氧（OGD/R）过程中细胞氧化应激和自噬过程。同时利用Western blot手段做辅助，充分证明细胞在OGD/R过程起始即会发生氧化应激，并在15 min时细胞开始发生自噬（如图三所示）。同时，上述结果显示出比率型荧光探针能够通过克服传统单一发射探针的诸多不足，通过提供两种不同波长的发射光谱，并将两者强度做比值得到的比率信号作为最终检测信号，实现对环境影响的进行内置校正，增加了在实时监测细胞OGD/R过程中荧光信号拐点的精准捕捉，从而增加了实时监测的准确性。图3 探针实时监测OGD/R过程中细胞自噬和氧化应激能力研究
最后，利用药物抑制（Apocynin，APO）和基因沉默（NOX-2KD）的方式抑制NOX-2蛋白表达，证明了OGD/R过程可导致NOX-2蛋白过表达从而引起细胞发生氧化应激并诱导细胞自噬的发生。如图四所示，APO组和NOX-2KD组相比于OGD/R组，比率信号均有明显降低，同时，阴性对照组的比率信号相比于NOX-2KD组有明显升高。以上实验充分说明NOX-2蛋白可以调控细胞发生氧化应激状态和细胞自噬。Western blot也证明了研究观点的准确性。更重要的是，CCK-8实验表明通过抑制NOX-2的表达可有效改善OGD/R过程对细胞的损伤（Fig. 4D），表明该方法可以应用于脑缺血再灌注损伤的治疗当中。
图4 探针评估OGD/R过程中细胞自噬与氧化应激的相互关系研究本工作开发了基于ICT-TBET机理的粘度&ONOO−双功能双光子比率型荧光探针（Mito-ONOO），以实时跟踪OGD/R过程中的自噬和氧化应激。该探针具有高保真成像粘度和ONOO−，线粒体靶向能力，双发射峰的基线分离，可在活细胞和体内以高分辨率和可靠性实现对自噬和氧化应激的实时原位追踪。据文献报到，Mito-ONOO是第一个通过比率分析实现OGD/R过程中自噬和氧化应激实时可视化的探针。研究显示在细胞氧糖剥夺并在进行复氧糖过程细胞随即产生ONOO−并导致细胞氧化应激的发生，在15 min后及有明显的细胞自噬的发生，该结果有潜力为脑卒中的诊断、治疗及药物设计提供新的靶点。以上相关成果分别以“Simultaneous tracking of autophagy and oxidative stress during stroke with an ICT-TBET integrated ratiometric two-photon platform”和“Near-infrared fluorescent probe for hydrogen sulfide: high-fidelity ferroptosis evaluation in vivo during stroke”为题均发表在Chemical Science上。论文的第一作者为陕西科技大学博士后胡伟博士，通讯作者为陕西科技大学强涛涛教授、中南民族大学李春涯教授和英国巴斯大学James. Tony D.教授。原文链接：
https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2022/SC/D1SC06805A
https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2022/sc/d1sc05930k
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