牙龈干细胞外泌体调控Wnt/β-catenin通路促进糖尿病创面修复作用机制研究

20240112

卫生和社会工作

本课题组长期致力于干细胞来源的外泌体对疾病治疗、组织再生相关方面的应用，同时也一直探索外泌体的相关应用方式、方法。在本项目中，我们主要提取了人牙龈间充质干细胞外泌体，并展开了相关的研究。就目前而言，外泌体是生物科学领域的热点，其分泌机制、提取纯化方法等均日趋成熟，本课题组自2016年起就致力于研究人牙龈干细胞来源的外泌体相关研究，不但熟悉人牙龈间充质干细胞的分离，提取，鉴定，培养，同时熟练掌握了人牙龈干细胞外泌体的分离方案，这为后期实现外泌体的转化、工程化外泌体的研发等均奠定了良好的基础。通过本项目的研究，本课题组为了提出实现外泌体的应用良好方案，希望将外泌体与不同的生物材料结合，作为伤口敷料或支架，再一同放置到损伤处，可提高外泌体作用的耐久性和稳定性。经过探索，将PLGA多孔微球、nHAP、EPL三者结合，制备出PLGA/nHAP/EPL（PHE）微球，并对微球的结构与相关性质进行表征，再将人牙龈间充质干细胞外泌体负载于微球上，作为后续体内实验输送外泌体的一种方法。目前已经熟练掌握该微球的制备技术，也为后期转化应用提供了实验基础。通过动物模型的研究，我们也证实了将多孔微球、外泌体联合应用促进糖尿病皮肤创面修复的可行性，有效性。综上，我们对于外泌体提取、微球制备，应用结合等方面均具备良好的转化基础。

本项目的关键点为干细胞、生物材料的结合以及对疾病治疗、组织再生的促进研究。基于我们的现有的研究结果与基础，关于成果的转化需求，需要拟合作方在此方面有一定的经营资质以及丰富的经验基础，先进的生产设备等，主要包括：1、拟合作方应该是致力于干细胞、外泌体技术开发与临床转化的相关企业。拟合作方应具备对外泌体研究与分子生物学、细胞生物学及生物信息学等相结合，具备外泌体研究与转化平台。硬件条件要求为：拟合作方具备不低于1000平米外泌体GMP中试车间，具备或者已建立成熟的外泌体生产工艺和质量表征体系，可提供工程化外泌体载体设计开发、工程化外泌体药物开发等服务，具备稳步实现相关生物制剂产品在GMP规范下规模化生产以满足市场转化需求。2、另一方面，本研究同时涉及到生物材料的研发，因此希望拟合作方之一为致力于组织再生领域生物材料研发生产的企业，具备相关行业标准的认证资质，有成熟的材料研发与检测设备，清洁生产车间（如大于300平米十万级标准的洁净车间，万级局部百级标准的无菌检验车间等），满足相关的需求，尤其是关于针对软组织创面修复与再生等方向纳米、微米级别可降解生物材料、生物敷料的制备与检测，生产等方面应该具有丰富的经验以及相应的资质要求。

可国（境）内外转让

对于糖尿病患者，长期病程会引起周围血管、神经的病变，容易导致皮肤的溃疡；而糖尿病状态下，又由于血管、神经受损，局部高血糖，炎症因子的高表达等因素的影响，又导致创面的延迟愈合，甚至是不愈合。这些并发症在临床中十分常见，例如糖尿病足部溃疡，褥疮，静脉淤血性溃疡等，严重的糖尿病肢端溃疡，甚至会引起坏疽、截肢等严重的后果。 据创伤愈合协会的数据，约有15%的糖尿病患者患有糖尿病性足部溃疡，而约有200万的糖尿病患者出现创面的感染。这些糖尿病性的慢性创面给卫生医疗保健系统带来了巨大的经济负担，仅在美国，每年对糖尿病足部溃疡的治疗费用就超过50亿美元。但是慢性创面的发病率仍在逐年上涨，每年新增200-300万患者罹患各种慢性创面。这也给患者带来了沉重的经济负担，严重的影响了患者的生活质量。 目前，中国的糖尿病患者人数居全世界首位，且多数患者被并发症所困扰，增加了家庭及国家的经济负担： 2015年中国糖尿病的患病人数为1.09亿人，超过全球患者的1/4，而预计到2035年，这个数字将上升至1.43亿。目前糖尿病是慢性创面患者住院的首要病因，其患病率已从1996年的4.91%上升到2008年的35.3%，这类患者平均住院日为31天，相关的医疗费用为1.7万余元。一项来自15家医院的多中心临床研究显示，中国糖尿病足患者的截肢率高达19.03%。快速增长的患病人数以及糖尿病各种并发症的高发，凸显了研究和实施更有效的预防、治疗糖尿病及其并发症有效方法的重要性。 本项目针对糖尿病创面采用干细胞外泌体和PLAG/nHA/EPL（EPL）多孔微球联合应用，可以有效实现糖尿病创面的修复愈合，这种方案应用方法简单，原料来源广泛，同时考虑到糖尿病患者人数庞大，因此具有巨大的社会经济效益。

北京市自然科学基金面上项目

北京市科学技术委员会;中关村科技园区管理委员会

本项目来源于北京市自然科学基金面上项目，项目编号7212091。糖尿病皮肤创面仍是临床上棘手问题，研究显示干细胞来源的外泌体可促进创面修复，为临床治疗提供了新思路。本项目在前期研究基础上，通过提取人牙龈干细胞（GMSCs）来源的外泌体（GMSCs-Exo），研究了GMSCs-Exo对人皮肤成纤维细胞（HSFs）、人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的生物学作用及机制。合成了具备抗菌性能、可负载外泌体的PLAG/nHA/EPL（EPL）多孔微球，并通过动物模型验证了将GMSCs-Exo与多孔微球材料联合应用于糖尿病皮肤创面的效果与可行性。结果显示我们成功提取GMSCs-Exo，透射电镜下呈圆盘状，大小为135.2±44.3nm，表达CD63和Tsg101。在高糖环境下，HSF/HUVECs能够摄取GMSCs-Exo。GMSCs-Exo能够显著促进HSFs和HUVECs的增殖、迁移，并可以有效促进HUVECs的小管形成能力。进一步研究显示，高糖环境下GMSCs-Exo能够上调β-catenin及其下游蛋白表达，而抑制Wnt/β-catenin通路后，下游蛋白表达及HUVECs功能均被抑制，表明Wnt/β-catenin通路在此生物学过程中发挥重要作用。成功制备了PHE多孔微球，直径6.71±1.72μm，平均电位37mv，可吸附带负电的外泌体实现外泌体负载以及缓释。此外PHE可以对大肠埃希菌、金葡菌以及耐甲氧西林的金葡菌产生明显的抑制。最后建立了糖尿病小鼠皮肤缺损模型，负载GMSCs-Exo的PHE多孔微球可有效的促进创面愈合，HE、免疫荧光染色等显示负载 GMSCs-Exo的PHE有效促进缺损区域角化、胶原与血管的新生。本项目证实了GMSCs-Exo具有良好的促进创面修复以及成血管能力，与PHE多孔微球是一种具有前景的糖尿病创面治疗的“无细胞治疗”策略。本项目内容成果帮助课题组获得军队科技进步二等奖1项，共计发表论文8篇，其中SCI论文3篇。