基于SERS技术和机器学习研发电子鼻对支气管扩张绿脓杆菌的诊断应用

20241222

1.1产品整体的设计思路 （1）呼出气纳米检测平台早诊系统构建： 临床中针对患者的呼出气标志物实现个位数ppm，至ppb级的高灵敏、高特异性联合检测。结合目标VOCs的物理化学性质，对MOFs结构中的金属簇与孔结构进行适当设计，包括金属簇的配位方式、分子构型和化学环境，孔道结构特点及表面化学性质等，充分利用VOCs和MOF主客体分子在空间和吸附能量上的加和与协同等多重结合机制，开发出针对支气管扩张症绿脓杆菌感染呼出标志物的高效MOFs气体阵列传感系统。对基于阵列传感器技术的纳米检测平台发展出的识别算法，利用主成分分析、层次聚类分析、线性判别分析等方法实现患者有效的信息提取和气味分辨。利用构建的针对支扩绿脓杆菌感染的人工仿真嗅觉系统，检测不同时期支扩绿脓杆菌感染呼出标志物的含量差异，确定不同阶段呼出标志物的含量和特点。 （2）开展电子鼻诊断效能研究：临床招募支气管扩张症患者，并以健康人群作为对照，所有支气管扩张症患者在入选时采集痰液培养确定致病菌，并根据痰细菌学评估将患者分为两组：绿脓杆菌感染和非绿脓杆菌感染；通过集气袋收集所有样本，连接电子鼻系统有效提取患者呼出气的信息，确定电子鼻的判别和诊断能力。 1.2产品构成 产品设计为一体机形式，内置循环泵，激光拉曼以及算法识别模块，主要功能为样本气体吸附和拉曼分析。气袋采集样本后插入设备进行吸附，吸附完成后激光拉曼进行采样分析，通过识别算法得出结果。具体流程： （1）采集1L呼气样本，将中段气吹入采集袋中，采集完成后关上开关，保持气袋密封。 （2）将气袋接口插入预设MOFs材料的循环泵系统，使气袋和循环泵系统形成闭环通路，开启循环泵完成5分钟循环富集。 （3）富集完成后，激光照射预设位置处MOFs材料，完成至少三处采样，大约15秒后可完成检测和识别结果。 1.3关键的作用机制与功能（见图1） 电子鼻通过使用广泛交叉反应的传感器阵列，传感器吸附VOCs并将其转换为电信号，结合模式识别分析，创建疾病的特定 “呼吸纹”。 MOFs超高的比表面积和原子级分散的次级金属簇不仅能对极微量VOCs进行抓捕，且能形成以金属配位为主、氢键、π-π共轭和笼体效应等弱作用力为辅的多元结合机制。因此，MOFs对VOC具有更加优越的吸附和辨识能力。此外，通过调控MOFs中金属簇的组成及分布，可以显著提升MOFs对于特定VOC的选择性吸附效能，满足对指定VOC有专一识别和高灵敏检测的要求。 拉曼光谱技术是根据拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以了解分子的化学结构、相和形态以及分子相互作用等详细信息的一种光谱分析方法。SERS则是通过电磁增强机制，使使拉曼信号极大增强，从而实现对痕量化合物的高灵敏、甚至是单分子检测和定量分析。申请人将通过设计和调控MOFs结构，强化吸附与电荷传递的协同作用，实现MOFs材料对VOC吸附分子的拉曼

3.1 市场情况 许多慢性肺部疾病具有非特异性的、往往重叠的症状，这延误了诊断过程和及时开始充分的治疗。大多数肺部疾病都缺乏准确、无创、实时的诊断工具和生物标记物来预测疾病病程和对治疗的反应，但对于实现针对个别患者的个性化治疗方法是必不可少的。就目前国内外研究看来，有潜力满足这一需求的新兴工具是电子鼻。呼出气检测在日常生活和临床上早已应用,如排查酒驾时的乙醇浓度测定、诊断胃部幽门螺杆菌感染时的13C/14C呼出气检测以及临床呼吸末CO2测定等。更有研究发现，与低剂量CT扫描相比，使用电子鼻检测肺癌的特异性更高；因此使用电子鼻技术作为筛查工具可以潜在地降低假阳性率，并防止不必要的(有创)检测。 有研究进一步阐述了呼出气分析在结核分枝杆菌感染中的应用,呼气挥发性有机物检测在绿脓杆菌感染及在曲霉菌感染中的应用。2011年,美国胸科协会制定了呼出气一氧化氮测定作为一种无创方法来诊断哮喘和监测抗炎治疗疗效的应用指南。有研究表明，电子鼻技术可以很好地将哮喘患者与健康对照组区分开来。两项研究也表明，哮喘患者的呼气指纹与慢性阻塞性肺疾病患者的呼气指纹存在显著差异。有两项研究报告称，在检测哮喘方面，电子鼻技术的性能优于常规调查(肺活量测定法或呼出一氧化氮试验)。国外部分研究已经明确电子鼻可准确识别临床稳定型支气管扩张症患者呼吸道细菌定植的VOC呼气指纹，定植有绿脓杆菌的支气管扩张患者与定植有其他致病微生物或非植菌的支气管扩张症患者的呼吸指纹存在显著差异，但尚未完成电子鼻对支扩绿脓杆菌感染诊断可能性的验证。我们通过前期的检验发现支气管扩张症患者呼出气与正常人的差异，也想通过检查及检测发现一种简易的途径用来诊断支气管扩张症合并绿脓杆菌感染，使患者实现提前干预及治疗。 3.2 商业模式 本项目商业模式以医院检测为主，通过诊断性实验检测电子鼻在支气管扩张症的绿脓杆菌气体检测中的灵敏度和特异度，产出一款便携式、高灵敏度的智能电子鼻。将普及于综合医院的呼吸科支气管镜室及肺功能检查室，设立绿脓杆菌呼气试验，对支气管扩张症进行早期诊断，早期筛查。不仅为临床诊断提出切实解决方案，同时通过采购合作公司检测设备作为检测平台，进入医院进行检测耗材销售，快速占领支扩支扩检测市场。 产业化阶段可在合作医院进行临床实验室自建项目（Laboratory Developed Test，LDT）检测服务，完成取证后进入医保体系，作为支扩合并绿脓杆菌诊断的全新标准。LDT阶段通过协作医院开展全国范围内的多中心取样，可吸引更多的合作医院，并收集全国范围内的样本信息，扩充检测数据库和增加临床样本的多样化。 对于基层医疗机构和不具备设立检测平台条件的用户，可采取邮寄检测样本至检测平台，完成检测反馈给医疗机构。即用较低的成本进行大规模的检测市场拓展。同时产品销售也采取经销商模式，借用现有成熟销售网络，对产品进行推广。

对现阶段产品进行了20例临床样本双盲检测，准确率达到85%。说明了该技术在支扩和肿瘤早期诊断方面的潜在应用。,我们前期通过对MOFs材料的适当改性，已经对支气管扩张患者（100例）、肺癌患者（100例）以及健康人（100例）呼出气样本进行了分析检测，获得了明显的区分效果。已授权两项专利。为了进一步对三类人群进行准确甄别，我们采用LDA数据模拟分析的方法对数据结果进行处理。选用LDA模型模拟分析后的散点图结果，每个样本每种材料的检测结果都各取五条谱线进行处理，以全谱图输入，仅对数据进行了峰位校正，不对谱线做平滑或者基线调整等其他处理。这种方法能够清晰的将两种疾病与健康人区分开， 我们对现阶段产品进行了20例临床样本双盲检测，准确率达到85%。说明了该技术在支扩和肿瘤早期诊断方面的潜在应用。

单纯依赖CT影像学和痰液培养进行支气管扩张症绿脓杆菌患者的诊断及病情监测效果不佳。在这些情况下，其他微生物学表征技术可能会有所帮助。,支气管扩张症（Bronchiectasis）是由于支气管及其周围肺组织反复发生化脓性炎症，致使支气管壁结构破坏，引起支气管异常和持久性扩张的常见呼吸系统疾病。反复感染会引起气道慢性炎症、气道内分泌物增多和气道廓清障碍，损伤气道纤毛上皮，导致痰液积聚、气道梗阻和气道破坏，造成病原微生物定植，进一步加重感染风险和气道破坏，形成恶性循环，严重损害肺组织正常结构和功能，致使患者肺功能下降、生活质量降低，造成沉重的心理、经济和社会负担。 绿脓杆菌是引起支气管扩张症急性加重的常见致病菌，多项研究表明，支扩患者急性感染期绿脓杆菌感染的占比约为30-40%，长期和广泛使用抗生素更会增加绿脓杆菌感染的风险；此外，绿脓杆菌对多种抗生素具有高度天然耐药性，易于产生耐药菌株并形成定植，约60%-80%的稳定期支气管扩张症患者气道内有潜在致病微生物定植，其中以绿脓杆菌最为常见。这种病原体不仅会加重患者的症状，还可能导致严重的并发症如肺脓肿、肺不张、败血症、多器官衰竭等，并与较高的生活质量下降、病情恶化率、住院人数增加和死亡率相关。因此，早期识别绿脓杆菌感染是控制本病的关键步骤。 目前支气管扩张症绿脓杆菌的临床诊断主要依赖于痰涂片及痰培养的诊断，亦可通过支气管镜、支气管肺泡灌洗液、分子生物学或免疫学检测。目前临床检测绿脓杆菌的金标准是痰培养，然而，痰培养容易受到口腔和上呼吸道正常菌群的污染，阳性率不足30%，其培养结果需要较长时间（48-72小时），且不能监测细菌载量，作为一种疾病监测手段十分有限。其它检查手段也存在包括费用高、敏感性和特异性低、有创性操作、感染出血风险高等问题。就目前国内外研究来看，有潜力满足这一需求的新兴工具是电子鼻。本项目即是通过对人体呼出气中特定VOCs的高灵敏、特异性进行检测，实现由绿脓杆菌定植感染造成的支气管扩张症的早期筛查与临床诊断。 前期研究发现MOFs在吸附和识别VOCs方面表现卓越，此外，通过调控MOFs中金属簇的组成及分布和表面增强拉曼光谱（Surface Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）技术的介入，可以显著提升MOFs对于特定VOC的选择性吸附效能，实现对痕量化合物，甚至是单分子的灵敏检测。