基于类器官技术适用于肺癌免疫合并化疗疗效预测的试剂盒的开发

20241222

1.类器官成为体外模型的关键技术 人类肿瘤的高度异质性限制了药物治疗成功，需要更精确的方法和模型反应肿瘤的复杂性，来帮助开发更有效的肿瘤疗法。虽然2D培养技术和小鼠异种移植技术在肿瘤生物学中取得了开创性的成就，但是它无法准确的反应肿瘤的生理微环境等关键特征。基于成体干细胞的类器官技术是一种多功能的技术，可以在体外生成并长期维持具有与天然结构类似的3D上皮组织。肿瘤类器官反应亲本肿瘤的病理学和基因组特征，并且在一定程度上保留了亲本肿瘤的异质性，能够以较低的成本和较高的通量对肿瘤药物反应性进行预测。 目前类器官已经被广泛用于包括结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌等多种人类肿瘤的药物反应性预测中。 类器官成本低、时间短、与体内正常生理相关性更高。肿瘤类器官培养技术被国际顶级杂志《Cell》评为2015年十大科技进展，被《NATURE METHODS》杂志评为2017年十大科技进展。该技术突破了传统在体模型、离体模型现有的局限性，肿瘤细胞在细胞外基质的支撑下，合适的细胞因子，成体上皮干细胞就会自发的组织形成3D细胞结构，使得原代肿瘤细胞可以高效形成药物检测模型，为研究人员提供了探索疾病发生及药物研发的功能因素的工具与平台。 2.共培养技术建立体外模型 人源肿瘤类器官免疫联合化疗模型的建立：取非小细胞肺癌患者手术活检或穿刺活检病理标本，进行单细胞化和三维培养。通过原代细胞和外周血中的免疫细胞共培养技术，分别建立肺癌单纯类器官模型和类器官和T细胞共培养模型，分别对应化疗和免疫治疗模型，并通过算法整合，确认个体化肺癌免疫联合化疗类器官模型。 本项目通过肺癌类器官共培养技术，使肿瘤原代细胞培养的技术突破了传统在体模型、离体模型现有的局限性，形成具有三维立体结构的微组织，与应答T淋巴细胞共培养可模拟肿瘤对免疫治疗的反应。形成免疫联合化疗预测模型，并结合肺癌化疗模型与临床疗效进行对照，为免疫合并化疗提供精准的体外模型。最终形成试剂盒并可以批量使用。

（一）潜在市场规模及预期产业化前景 肺癌作为目前发病率及死亡率列于前位的癌种，在国际、国内的治疗中都有很大的需求。从患者自身的肿瘤组织建立活细胞模型，在体外测试药物对肿瘤活细胞的药效，不仅可以为初治肺癌患者治疗提供疗效预测，也可为常规治疗已经失效的肿瘤患者推荐治疗方案。 国际市场：全球肺癌新增确诊病例达220万，单次检测1500美元，220万x1500=33亿美元。国内市场：国内新增肺癌确证病例82.8万 按单次10000人民币，国内市场为82.8万x10000=82亿8000万人民币。目前已经在治疗过程中的患者，由于耐药性的存在，也需要在耐药后重新取材进行药物敏感性检测，具有市场需求。 （二）预期解决临床真实需求 肺癌在我国是癌症发病率、死亡率居于第一位的恶性肿瘤。是对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。肺癌的治疗呈现出多渠道、多方式。以PD-1、PD-L1抗体为首的免疫阻断点疗法为为肺癌的治疗开启了一个新时代，取得了令人瞩目的临床效果，是目前最有潜力治愈恶性肿瘤的手段。临床要求也使免疫治疗要更加合理与精准的趋势。 国际顶级期刊《Cell PRESS》指出目前免疫治疗的“十大挑战”之首即为“免疫治疗的临床前模型的发展”。临床上目前的类器官免疫治疗功能性检测模型试剂盒将广泛用于具有免疫合并化疗的可能性的患者的用药前的预测，进行筛选后使患者用药后的有效率提高，并且为初治未采取免疫合并化疗的患者再其他治疗耐药后再选择。

（三）同类产品或技术稀缺性 随着类器官技术的发展、技术成熟，使得研究者能够培养出稳定、高活力的类器官模型。类器官技术的进步也进一步促进了肿瘤类器官的研究继而推动了肿瘤基础研究和新药研发的速度与模式。国际上美国的X cell Biosciences公司。国内科途医学有限公司、创芯国际有限公司以类器官技术较为成熟，大橡科技作为类器官和微流控结合的公司。但目前类器官共培养技术尚未成熟和市场化，无此类化疗合并免疫治疗的试剂盒产出。

1.临床实验及科研课题取得成果： 团队2017年获得北京市通州创新人才奖励 “肺癌类器官精准治疗平台”开始对肺癌类器官培养进行研究，2018-2020年北京市属医院科研培育计划 基于3D类器官技术龙葵提取物澳洲茄边碱在肺癌中抗癌功能的研究，及2020年北京市通州区科技计划项目 基于类器官肺癌模型先导化合物高通量筛选平台的建立了小规模肺癌类器官其中手术标本建模成功率85%以上，穿刺标本建模成功率65%以上，建模周期稳定在3-4周左右。本团队从肺癌手术标本中建立了肺癌类器官培养的技术平台，已经建立小规模类器官标本库。并对抗肿瘤先导化合物进行研究，明确了澳洲茄边碱、苦参碱、骆驼蓬碱等在肺癌中的作用以及部分机制。 2017年接受横向课题“十三五重大新药创制专项”中的子课题《埃克替尼用于EGFR 敏感突变患者术后辅助治疗的I期临床研究》及2019年通州科技计划“肺腺癌PDTO模型在精准化疗中的应用研究”以肿瘤类器官原代细胞培养技术为基础，建立肺腺癌患者的PDTO临床前模型，并利用此临床前模型预测临床化疗和靶向治疗的效果，与临床真实用药效果进行对照，结果显示，无论化疗还是靶向治疗，阴性及阳性预测均在80%以上。 2023年获批北京市通州区科技计划项目”基于恶性胸腔积液肺癌类器官免疫精准治疗模型的建立”开始利用建立类器官与免疫细胞共培养体系：在添加外源性免疫成分的浸没基质中进行上皮细胞类器官培养，共培养体系用于模拟免疫检查点治疗反应。在分别扩增患者来源的肿瘤类器官和肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TILs)后进行共培养。作为肺癌免疫治疗的体外模型，2023年首都医科大学附属北京胸科医院建立肺癌类器官库，并获批北京市属医学科研院所公益发展改革试点项目（JYY2023-15）“肺癌免疫治疗类器官样本库建设及诊疗关键技术研究”，课题组获得其中子课题“子课题“肺癌可手术患者新辅助疗法队列建设和疗效预测新技术、新标志物研究”目前对于肺癌免疫治疗模型已经初步建立40例，阳性预测值达到75-80%，隐形预测值80-85%。 2.获得的专利： 2022年根据前期结果申报并获批专利（1）发明型专利：一种可扩展结构及普适性癌症类器官体外培养装置 授权号CN 112680355 B 2022年 （3）实用新型专利：一种肺癌原代细胞 3D 培养装置 授权号 CN 215560389 U 2022年。（3）一项发明型专利“一种基于恶性胸腔积液的肺癌类器官培养模型”已受理，申请号或专利号：202310925653.X 3.验证方法： 肺癌类器官与源器官验证采取通过ARMS-PCR技术，证明了类器官模型所携带的基因突变和肿瘤组织相同。通过短串联重复序列(short tandem repeats,STR)鉴定，证明来自肿瘤组织DNA中的短串联重复序列（数字）和来自类器官模型DNA的短串联重复序列（数字+X）完全一致。【见表1：短串联重复序列(short tandem repeats,STR)鉴定】,项目组前期已经获得稳定的肺癌类器官培养，成功率超过90%，建立了肺癌化疗及靶向治疗类器官模型，阳性预测值及阴性预测值均超过80%，并获得发明型专利一项和实用新型专利一项的授权。本项目基于课题组已经建立的肺癌类器官培养，进行药敏检测的技术，进一步开发共培养技术，从肺癌组织分离浸润淋巴细胞，或者从外周血分离自体外周血淋巴细胞肺癌类器官和自体免疫细胞共培养，建立具有免疫微环境的类器官自体免疫共培养模型，加入免疫调控药物（例如，抗PD-1抗体，双特异性抗体等），通过分析肿瘤类器官作为靶细胞被杀伤，以及检测效应细胞激活的程度，通过临床实际疗效进行分组，建立可以区分临床治疗效果的组合算法，以此为模型开发试剂盒，为免疫合并化疗提供疗效预测。

肺癌免疫治疗获益人群的选择 在我国，肺癌的发病率与死亡率已居高不下，是我国恶性肿瘤致死原因首位疾病,死亡率40年间上升近10倍。通过诸多治疗方式如手术、化疗、靶向、免疫、中医等多学科综合治疗的联合实用，肺癌的治疗策略呈现出多渠道、多方式、多学科的形势。 免疫检查点分子是一类能调控免疫细胞活化的膜表面调节蛋白，在维持免疫稳态中发挥关键作用。针对免疫检查点使用抗体，以PD-1、PD-L1抗体为首的肿瘤免疫治疗新技术的成功更为肺癌的治疗开启了一个新时代。免疫联合化疗的联合治疗对于不同患者会有不同的反应，化疗不仅可以直接杀伤肿瘤细胞，而且可以通过杀伤肿瘤细胞为免疫治疗提供免疫原及免疫危险信号，从而激活先天免疫和继发免疫水平，增强对肿瘤细胞的杀伤效果。多项临床实验证实，新辅助免疫合并化疗治疗在多项终点均有优势，如病理学消退深度、客观缓解率（objective response rate，ORR）和降期率等。从而证实免疫合并化疗治疗在 NSCLC 患者中应用价值与前景。目前，免疫联合化疗已成为肺癌一线治疗的主要选择方案之一。 但这种治疗方式也存在一定的问题，最新临床发现：虽然抗 PD-1/PD-L1抑制剂联合化疗比单纯化疗及免疫疗效更好；但PD-1/PD-L1抑制剂仍有明显的选择性，即仅在部分患者中可取得良好的疗效，文献报道然而，临床上大约 60%的患者未能从中获益。 临床个体化治疗的要求使免疫治疗有更加合理与精准的趋势。鉴于癌症的免疫逃逸机制多种多样，提高免疫治疗效率需要建立能够维持癌细胞生物学特征的、临床相关性强的体外模型分析。国际顶级杂志CELL PRESS 认为免疫治疗十大问题首要问题就是“临床前免疫治疗模型”。在患者开展治疗前，便可预测免疫合并化疗治疗手段对其是否有效，最大限度避免无效治疗是临床目前面临的重要问题。,肺癌在我国是癌症发病率、死亡率居于第一位的恶性肿瘤。是对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。肺癌的治疗呈现出多渠道、多方式。以PD-1、PD-L1抗体为首的免疫阻断点疗法为为肺癌的治疗开启了一个新时代，取得了令人瞩目的临床效果，是目前最有潜力治愈恶性肿瘤的手段。 （1）本课题自主构建肺癌组织类器官与肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）共培养，建立分析免疫细胞和肿瘤相互作用的体外系统。虽然国际也有此类模型，但未有大规模进行临床验证，国内模型也未有临床验证，本项目属于国内领先。 （2）本课题建立共培养体系，利用类器官+TIL共培养模型进行免疫检查点抑制剂功能性检测。研发一款广泛应用的共培养技术肺癌免疫治疗体外药效预测模型的试剂盒。目前国内尚无此类试剂盒，填补国内空白。 （3）本课题自主构建肺癌组织类器官与TIL细胞共培养，建立分析免疫细胞和肿瘤相互作用的体外系统及肺癌类器官和TIL共同培养的条件，利用类器官+TIL共培养模型进行免疫检查点抑制剂功能性检测。利用课题组前期发明型专利技术，在同类技术中类器官培养成功率更高，共培养的效率更高，预计在今后的市场上会领先于国内产品。