REDD1/mTORC1信号通路调控肌腱干细胞膜片组织生物力学特性的实验研究

20220126

卫生和社会工作

1、 课题组成功将小鼠肌腱干细胞分离并且对其进行干细胞特性鉴定。 2、在优化了肌腱组织力学培养环境以及成功分离了小鼠肌腱干细胞后，课题组成功利用力学刺激将肌腱干细胞分化成肌腱组织如下图。 3、课题组进一步的定位REDD1是肌腱干细胞对力学刺激的感受器，并且REDD1的信号抑制参与了新生肌腱组织的形成。 4、为了研究mTORC1信号通路的抑制对肌腱体内受力刺激保护的影响，我们针对mTORC1信号通路抑制所需的上游激酶REDD1，构建了肌腱特异性REDD1敲除小鼠 SCX-REDD1,并且对其进行了跑步机模型断裂。我们发现SCX-REDD1小鼠的跟腱比野生型小鼠跟腱要大。而且当我们对其进行仅仅低强度训练后， SCX-REDD1小鼠的跟腱并未发生变形甚至断裂情况，如下图。于是我们认为REDD1/mTORC1信号通路对小鼠肌腱受力保护机制起重要的作用. 5、为了进一步研究 SCX-REDD1小鼠在受力情况下肌腱的保护机制，我们对其跟腱进行 CMP-TARMA 染色，我们发现在野生小鼠在跑步机训练后，其跟腱组织中有大量的变性胶原累积，而SCX-REDD1小鼠却没有，如图。于是我们认为大量的变性胶原累积是野生小鼠跟腱变细和断裂的原因。 6、为了研究mTORC1信号通路的抑制对肌腱体内受力刺激保护的影响，我们针对mTORC1信号通路抑制所需的上游激酶REDD1，构建了肌腱特异性REDD1敲除小鼠 SCX-REDD1,并且对其进行了跑步机模型断裂。我们发现SCX-REDD1小鼠的跟腱比野生型小鼠跟腱要大。而且当我们对其进行仅仅低强度训练后， SCX-REDD1小鼠的跟腱并未发生变形甚至断裂情况，如下图。于是我们认为REDD1/mTORC1信号通路对小鼠肌腱受力保护机制起重要的作用. 7、TDSCs单层培养在单轴和双轴刺激下细胞增殖能力和信号通路差别显著 8、单轴3D负荷牵拉可促进TDSCs的成肌腱分化及AKT信号通路的激活。 9、3D生物反应器中的单轴负荷能促进新生肌腱组织的形成 10、携带Sox11或空载体的AAV感染TDSCs。我们发现Sox11可以促进TDSCs的增殖和成骨分化，并在体外促进血管生成。western blot分析显示，Sox11能激活PI3K/Akt信号通路，促进TDSCs成骨。 研究目前处于基础研究阶段，还未具有成果转化的条件。

（1）构建肌腱特异性敲除REDD1小鼠（SCX-REDD1） 体外研究：在SCX基因敲除小鼠的基础上，构建特异性敲除REDD1的转基因小鼠。理论上REDD1敲除后，小鼠肌腱中的mTORC1信号通路处没有了抑制作用，那么特异性敲除REDD1的小鼠和野生型小鼠相比较，SCX-REDD1小鼠的跟腱要比野生型大，胶原排列成熟也量大，肌腱细胞增殖也多。 （2）肌腱干细胞膜片组织结构构建方法和自主设计的3D生物力学刺激仪。 体外实验：按照前期研究方法，分离培养及鉴定SCX-REDD1小鼠和野生型小鼠来源的肌腱干细胞，进一步在体外构建细胞膜片结构。并在自主设计的3D生物力学刺激仪作用下构建人工肌腱组织。 （3）构建REDD1/mTORC1肌腱特异性可诱导敲除小鼠模型 利用SCX-CreER工具鼠， 并成功构建肌腱特异性可诱导 REDD1 敲除小鼠模型（SCX-CreER-PDK1）。在未经过 Tamoxifen 诱导敲除之前，肌腱中REDD1 的表达正常，与野生型小鼠无异。但是经过 Tamoxifen 注射后， CreER 会被激活从而对 REDD1 两端的 LoxP 进行剪切，从而对REDD1 进行敲除。 研究目前处于基础研究阶段，还未具有成果转化的条件。

仅限国内转让

（1）对于间充质干细胞的成肌腱分化，有研究报导结缔组织生长因子（CTGF）和抗坏血酸（维生素C的一种形式）在胶原及细胞外基质合成、调节细胞成肌腱分化方面扮演着重要的角色。我们的前期研究尝试在体外利用生长因子刺激促进肌腱干细胞的成肌腱分化，构建细胞膜片结构，并进一步组织工程化形成不含外源性生物材料的组织工程化肌腱，用于肌腱及韧带的功能性再生。本研究构建的组织工程化肌腱不含外源性生物材料是本项目的特色之一。 （2）特异性敲除REDD1是否在反复力学刺激下保持肌腱组织结构及力学特性。体外实验：利用前期研究构建的3D力学刺激模型，使用力学刺激将肌腱干细胞膜片分化成新生肌腱组织，通过组织病理学及分子生物学方法鉴定特异性敲除REDD1是否可以保持肌腱的力学特性，是本项目的特色之二 （3）REDD1/mTORC1肌腱特异性可诱导敲除小鼠模型 利用SCX-CreER工具鼠， 并成功构建肌腱特异性可诱导 REDD1 敲除小鼠模型（SCX-CreER-PDK1）。在未经过 Tamoxifen 诱导敲除之前，肌腱中REDD1 的表达正常，与野生型小鼠无异。但是经过 Tamoxifen 注射后， CreER 会被激活从而对 REDD1 两端的 LoxP 进行剪切，从而对REDD1 进行敲除。 （4）REDD1/mTORC1可诱导敲除小鼠的力学刺激 SCX-CreER-REDD1 进行跑步机锻炼，在实验组中对 REDD1 进行 Tamoxifen 注射诱导敲除，而在对照组中则用生理盐水代替。在锻炼中我们将对小鼠的步态进行检测，在锻炼后对其组织进行分析，从而确立REDD1/mTORC1在力学刺激下对肌腱保护的作用。 研究目前处于基础研究阶段，还未具有成果转化的条件。

北京市自然科学基金面上项目

北京市科学技术委员会;中关村科技园区管理委员会

主要研究成果 1、课题组成功将小鼠肌腱干细胞分离并且对其进行干细胞特性鉴定。 2、在优化了肌腱组织力学培养环境以及成功分离了小鼠肌腱干细胞后，课题组成功利用力学刺激将肌腱干细胞分化成肌腱组织。 3、课题组进一步的定位REDD1是肌腱干细胞对力学刺激的感受器，并且REDD1的信号抑制参与了新生肌腱组织的形成。 4、为了研究mTORC1信号通路的抑制对肌腱体内受力刺激保护的影响，我们针对mTORC1信号通路抑制所需的上游激酶REDD1，构建了肌腱特异性REDD1敲除小鼠 SCX-REDD1,并且对其进行了跑步机模型断裂。我们发现SCX-REDD1小鼠的跟腱比野生型小鼠跟腱要大。而且当我们对其进行仅仅低强度训练后， SCX-REDD1小鼠的跟腱并未发生变形甚至断裂情况。于是我们认为REDD1/mTORC1信号通路对小鼠肌腱受力保护机制起重要的作用. 5、为了进一步研究 SCX-REDD1小鼠在受力情况下肌腱的保护机制，我们对其跟腱进行 CMP-TARMA 染色，我们发现在野生小鼠在跑步机训练后，其跟腱组织中有大量的变性胶原累积，而SCX-REDD1小鼠却没有。于是我们认为大量的变性胶原累积是野生小鼠跟腱变细和断裂的原因。 6、为了研究mTORC1信号通路的抑制对肌腱体内受力刺激保护的影响，我们针对mTORC1信号通路抑制所需的上游激酶REDD1，构建了肌腱特异性REDD1敲除小鼠 SCX-REDD1,并且对其进行了跑步机模型断裂。我们发现SCX-REDD1小鼠的跟腱比野生型小鼠跟腱要大。而且当我们对其进行仅仅低强度训练后， SCX-REDD1小鼠的跟腱并未发生变形甚至断裂情况。于是我们认为REDD1/mTORC1信号通路对小鼠肌腱受力保护机制起重要的作用. 7、TDSCs单层培养在单轴和双轴刺激下细胞增殖能力和信号通路差别显著 8、单轴3D负荷牵拉可促进TDSCs的成肌腱分化及AKT信号通路的激活。 9、3D生物反应器中的单轴负荷能促进新生肌腱组织的形成 10、携带Sox11或空载体的AAV感染TDSCs。我们发现Sox11可以促进TDSCs的增殖和成骨分化，并在体外促进血管生成。western blot分析显示，Sox11能激活PI3K/Akt信号通路，促进TDSCs成骨。 关键技术 1、自主研发的力学刺激仪器。 2、利用SCX-CreER工具鼠， 并成功构建肌腱特异性可诱导 REDD1 敲除小鼠模型（SCX-CreER-PDK1）。 核心数据及经济价值等 利用前期研究构建的3D力学刺激模型，使用力学刺激将肌腱干细胞膜片分化成新生肌腱组织，通过组织病理学及分子生物学方法鉴定特异性敲除REDD1可以明显保持肌腱的力学特性。