细胞内DNA损伤响应与钙离子信号系统的交互作用研究

20251030

科学研究和技术服务业

仅完成基础科学研究

没有

可国（境）内外转让

北京市自然科学基金本科生“启研”计划

北京市科学技术委员会;中关村科技园区管理委员会

DNA损伤应答（DNA damage response, DDR）是细胞内高度复杂的信号传导网络，帮助细胞感知DNA损伤、协调DNA损伤修复或决定细胞命运，是细胞应对DNA损伤的核心防御系统。胞内钙信号系统是细胞内动态的钙离子（Ca2+）浓度调控网络，利用Ca2+作为信号媒介，响应细胞内外刺激以协调多种细胞功能。这两个信号系统均已被广泛研究，且对细胞功能具有重要的调节作用。然而，它们在细胞内传导时是否存在交互作用，以及它们的交互作用如何影响细胞的生理和病理进程目前仍不清楚。本研究通过在细胞中表达钙离子指示剂GCaMP6s蛋白检测DNA双链断裂损伤（DNA double strand breaks, DSBs）后细胞内Ca2+浓度变化，减少外源及内源的Ca2+供应后研究细胞对DSBs损伤的响应等方法探讨两种信号系统在细胞内是否存在交互作用。发现DSBs损伤可诱导被损伤细胞及邻近细胞内Ca2+浓度的迅速上调；降低细胞内Ca2+浓度会影响重要DDR因子NBS1向DSBs位点的募集，减少DSBs诱导的ATM及H2AX磷酸化，从而减弱细胞对DSBs的响应能力。此外，降低Ca2+浓度还可增加肿瘤细胞对诱导DSBs损伤的化疗药物依托泊苷的敏感性。研究结果表明，DDR与胞内Ca2+信号系统存在交互影响，且干扰Ca2+供应可影响肿瘤细胞对诱导DSBs的化疗药物的敏感性。我们在开始本课题的研究工作时发现瞬时转染GCaMP6s质粒的细胞并不适合观察Ca2+信号的波动，因此不得不一边优化实验体系一边进行研究探索。我们得到了稳定表达GCaMP6s的单克隆细胞株，发现单克隆细胞株确实比简单的瞬转或稳转细胞对于在活细胞中观察Ca2+浓度的波动更有优势，这为后续的研究打下了坚实的基础！有意思的是，我们筛选到的稳定表达GCaMP6s的单克隆细胞株中绿色荧光的强度也会有所差异（图1C）。单克隆细胞株中GCaMP6s蛋白的表达量应该是一致的，荧光强度不同意味着不同细胞中Ca2+浓度有所差异。未同步化的培养细胞处于不同的细胞周期，我们推测这可能是造成不同细胞中Ca2+浓度差异的原因。我们曾尝试将细胞同步化到S期，发现同步化确实可以减少细胞间荧光强度的差异。为何处于不同细胞周期的细胞内Ca2+浓度有差异以及这种差异对细胞的生理及病理进程有何影响是一个非常有意思的科学问题。 本课题的研究发现Ca2+信号与DSBs损伤响应存在交互作用。DSBs损伤可以提升细胞内Ca2+浓度，细胞内Ca2+的浓度也会促进DSBs损伤信号的传导。关于细胞内的Ca2+对DSBs损伤的响应机制我们仍然知之甚少。细胞核内DSBs损伤信号如何被Ca2+信号网络识别、扩散，信号如何传导到核外细胞质，甚至传递到周边细胞仍不清楚。我们初步的研究显示减少培养基中Ca2+供应及抑制胞内Ca2+库Ca2+的释放都会减弱DSBs损伤诱导的钙离子波动，说明DSBs损伤信号促发了细胞内钙库及细胞膜上钙离子通道的开启，但具体的分子机制仍有待澄清。此外单个细胞核内DSBs信号如何促发未受损伤的细胞中Ca2+浓度波动也是未解之谜，这种跨细胞的信号互扰的机制及其生理、病理意义都有待揭示。Ca2+浓度对DDR的影响我们也只是进行了初步探索。我们发现Ca2+可以通过影响NBS1到DSBs的募集影响DSBs损伤信号沿NBS1-ATM-γH2AX轴传递，但具体Ca2+如何影响NBS1的募集仍不清楚。除了DDR信号的起始，Ca2+是否也影响DDR信号的效应，如DSBs损伤修复、受损伤的细胞命运决定等也不清楚。我们初步的实验结果显示抑制Ca2+的供应会增加肿瘤细胞对诱导DSBs生成的化疗药物的敏感性，这可能是由于Ca2+帮助DSBs损伤信号的识别与传导，也可能是由于Ca2+对于DSBs损伤的修复甚至细胞最终走入凋亡或衰老等途径产生影响。但不管何种机制，我们的结果都支持可以通过干扰Ca2+的供应来实现对肿瘤放、化疗的增敏效应，如果这一机制能进一步的在体内实验证实，势必对肿瘤的临床用药提供有益的帮助。