基于纳米孔基因测序技术的宫颈瘤变检测试剂盒的研发和临床应用

20241222

整合态HPV发挥致癌的生物学效应，而游离态的HPV无生物学效应。HPV DNA整合入人类基因组中，编码癌蛋白或者干扰抑癌基因的作用，导致宫颈癌变的发生。 本研究采用纳米孔测序技术检测人类基因组中整合态的HPV插入信息，检测HPV的插入位点和插入频率。纳米孔测序技术是最近几年兴起的新一代测序技术，它的特点是单分子测序，测序读长长，测序速度快，测序数据实时监控，机器方便携带等。纳米孔测序的基本原理是单链DNA或RNA经过纳米孔时会引起电流变化，由仪器记录电流的变化并对电流图形进行识别，转化为碱基的识别，最终实现对单链DNA或RNA的测序。纳米孔测序可实时检出基因变异/修饰，应用于长片段核酸结构变异和病毒插入位点检测领域，在检出率、准确性和检测时间上具有突出的优势，此方法在生命科学领域得到广泛应用，尤其在病毒和其他病原微生物鉴定方面具有很大的应用前景。 本研究采用纳米孔测序技术检测人类基因组的碱基序列，并识别其中外源性的HPV序列，包括插入位点，插入序列，插入频率等信息。一方面可以保证检测到的HPV是整合状态的，是可以发挥生物学功能的HPV。另一方面可以检测HPV的插入位点，插入序列，插入频率等信息，查询生物信息学数据库，分析HPV插入序列的功能和HPV插入后导致的异常生物学效果。进一步结合临床病理数据库，总结和分析HPV的整合信息与宫颈病变的相关性。前期研究结果表明HPV插入频率越高，宫颈病变越严重。 研究目标：1.寻找宫颈炎/宫颈病变的特异性基因；2.寻找宫颈炎/宫颈病变的特异性分子标志物及检测试剂；3.构建宫颈病变检测试剂盒；4.建立HPV整合信息数据库和宫颈病变的数据库。5.根据HPV整合数据库和其他生物信息数据库的相关性，研究其潜在的信号通路，构建宫颈病变AI预测模型。

市场情况 宫颈癌筛查是育龄期及老年女性必须的筛查项目，市场需求量大，目前的HVP检测和细胞学筛查方法均存在一定技术缺陷，本研究所构建的宫颈病变检测试剂盒可以有效避免上述缺点，提高宫颈病变检测的准确性，提高医疗效果，具有巨大的社会效益。 根据2022年国家统计局数据，30-65岁的女性需进行HPV检测，该年龄段女性数量约为3.4亿，市场规模约为83.63亿元。全球宫颈癌筛查市场预计将从 2022 年的 49 亿美元上升到2027年的 92 亿美元，具有良好的经济效益。团队研发的宫颈病变检测试剂盒，基于先进的基因测序技术，敏感性和和特异性高，诊断结果准确性高，实现宫颈病变的精准诊断和分流、减少漏诊，有望替代目前宫颈癌筛查方法。 本研究发明的检测仪器及检测试剂盒和预测软件使用方法简单，准确率高，性价比高，价格事宜，适用于各级别医疗及保健机构使用，适用范围广泛，面向人群巨大，由非常广阔的市场前景。 商业模式 预期未来产品的盈利模式、推广模式、运营模式 盈利模式：本产品的盈利项目包括检测试剂盒的费用，检测和报告的费用。宫颈病变预测软件的检测费用以及升级维护费用。 推广模式：本产品适用于各级医疗机构和健康体检机构。本产品的推广需要关注以下几点:1、宣传：重点突出本产品的优势，准确度高，价格便宜，可取代HPV和TCT。2、宣传对象：包括患者和医生，使患者了解新的宫颈病变检测方法及其优势，使医生熟悉纳米孔测序技术在宫颈病变检测方面的应用及优势。 运营模式：本团队拟根据产品建立产品研发团队，负责产品的开发升级，负责产品检测结果的质控。建立经营团队，负责产品的对外推广，授权和监管产品的生产和销售。

初步筛选宫颈病变基因位点，并申请专利 研究团队前期分析了95例患者宫颈样本，研究发现HPV插入负荷与病理分期关联，是疾病进展一个指标。研究发现33525个HPV整合位点信息，相关插入基因（包括基因内部与侧翼序列）为12760个。生信分析鉴定出癌前病变和癌症进展复发时期样品共有的含HPV插入位点的基因4804个，其中4400多个基因是新发现的基因。其中在炎症组中，DOCK3的mRNA量显著降低，但ACTR3B基因的表达无明显改变。在CIN 组中，ACTR3B基因的表达下降明显，但DOCK3的mRNA量并没有明显降低。经过95例临床样品的初步验证表明HPV基因在DOCK3基因及其附近的插入是炎症特有现象，HPV基因在ACTR3B基因及其附近的插入是CIN特有现象。据此构建相应的检测试剂盒并申请获批专利两项。,本研究目前研究发现33525个HPV整合位点信息，相关插入基因（包括基因内部与侧翼序列）为12760个。鉴定出癌前病变和癌症进展复发时期样品共有的含HPV插入位点的基因4804个，其中4400多个基因是新发现的基因。研究发现随病变进展HPV插入频率依次递增。通过HPV插入位点谱检测，预测晚期宫颈癌治疗后复发转移风险初步得到验证。研究发现宫颈病变相关的特异基因及分子标记物DOCK3和ACTR3B，获批了2项发明专利。

本研究所产生的成果可以提高HPV检测的准确性，发现整合态HPV感染，提高宫颈癌变预测的准确性，降低宫颈癌的发生率。,问题1.宫颈癌的发病率逐年增高且越来越年轻化 宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤，严重威胁女性健康。《2020全球癌症统计报告》数据显示，2020年全球女性宫颈癌新发病例60余万例，死亡病例34余万例。根据国家癌症登记中心统计数据，2016年宫颈癌新发病例数约为11.9万例，死亡人数约3.7万，并且发病呈年轻化的趋势。2022年新发宫颈癌为11.1万例，死亡6.1万例。我国宫颈癌的发病率及发病人数高于发达国家。 2021年WHO发布了最新的宫颈癌前病变筛查和治疗指南，提出优化诊断工具与筛查方法，促进宫颈癌预防并挽救更多生命的目标。2020年11月17日，世界卫生组织提出《加速消除宫颈癌全球战略》，计划2030年需实现全球消除宫颈癌。中国政府全力支持世界卫生组织的战略，中国优生科学协会阴道镜和宫颈病理学分会（CSCCP）制定了中国子宫颈癌筛查及异常管理相关问题的专家共识，实现宫颈癌早防、早诊、早治。 问题2.宫颈癌筛查存在不足 宫颈癌是人类目前唯一病因明确、可以预防、可以消灭的恶性肿瘤，但目前临床上宫颈癌筛查及异常管理存在不足：HPV检测存在敏感度高，特异性较低的缺点，误诊率高，细胞学的假阴性率高，漏诊率高，对宫颈癌的筛查结果造成一定的影响；过度阴道镜筛查，非HPV16、18型的其他高危型HPV感染者存在漏诊风险。组织病理学诊断为LSIL的患者存在恐癌焦虑或过度干预。因此临床急需一种敏感度高，特异性高的检测方法，实现对宫颈癌的早期诊断、精准分流、适时干预、减少漏诊具有重要意义。 问题3.宫颈手术损伤甚至丧失年轻女性生育功能 宫颈病变诊疗指南指出，宫颈病变II级(CIN2)及以上的患者应行宫颈锥切术或宫颈癌根治术。宫颈锥切术后可能造成不孕、流产、早产等不良妊娠结局。宫颈癌相关手术将永远丧失生育功能。宫颈癌的早期筛查、早期诊断阻止病变发展，对保护女性生育功能具有重要意义。因此敏感度高，特异性高的HPV检测方法，对于宫颈癌的早期诊断具有重要意义。 本研究根据中国人群HPV感染特点，设计了符合中国人群特点的基因检测探针组，可有提高检测的准确性和实用性。