基于口腔粘膜细胞a-突触核蛋白检测的帕金森病诊断新技术

20241222

1）产品的设计思路： 采集简便性：基于口腔粘膜细胞α-突触核蛋白检测的PD诊断试剂盒的设计具有采集样本的便捷性，使患者能够方便地收集口腔粘膜细胞样本。 病理性α-Syn种子活性检测：诊断试剂盒、诊断仪的核心是检测样本中的病理性α-Syn种子活性。通过检测口腔粘膜细胞样本中的病理性α-Syn种子活性，可以实现对PD的早期诊断和前驱期预警。 检测准确性：诊断试剂盒、诊断仪的设计目标是提供准确度高的检测结果，以确保对PD的敏感性和特异性。 诊断仪：一种自动化系统，能够精确控制试剂的加入、反应的时间和温度，并能生成、分析和解读结果。 诊断仪可实现自动化：能够自动进行试剂的加入、混匀、反应和测量等步骤；高通量：可同时处理多个样本，提高诊断效率；数据分析：具有数据分析和结果解读的功能，可以自动生成诊断结果，并提供数据存储和报告功能。

2）产品构成： 采集工具：诊断试剂盒、诊断仪包括专门设计的采样棉签，用于采集细胞样本，以确保有效的采集和保护样本的完整性。 样本处理试剂：诊断试剂盒中包含样本处理试剂，用于细胞裂解、蛋白溶解等，以提取口腔粘膜细胞中的α-Syn蛋白。 α-Syn检测试剂：诊断试剂盒中包含用于检测α-Syn种子活性的特定试剂和试剂体系。 阳性/阴性对照样品：诊断试剂盒、诊断仪包含阳性和阴性对照样品，以验证诊断试剂盒、诊断仪的性能和检测结果。阳性对照样品含有已知的病理性α-Syn种子活性，而阴性对照样品不含病理性α-Syn种子活性。说明书：诊断试剂盒、诊断仪提供有详细的使用说明，包括样本采集和处理步骤、实验操作方法、结果解读指南等。说明书清晰明了，方便用户正确操作，可解释如何解读检测结果。

一、现况分析 PD作为世界上第二常见的神经退行性疾病，其病理特征是α-Syn在脑部的病理性聚集。PD的发病率呈逐年上升趋势，60岁以上人群PD的患病率约为1%，且随年龄增长而增高，老龄化加剧，目前国内PD患者人数约为300万，患者数量全球第一。目前PD的诊断主要依据病史和体格检查，病程5年内的PD诊断准确率较低。目前尚缺乏敏感性高、特异性强、重复性强的PD生物学标记物。对于PD早期精准诊断、早期干预治疗、临床前期预防等需求十分迫切。 现有诊断技术和方法面临瓶颈，存在有创风险、费用高昂、可及性低的问题。RT-QuIC技术检测PD口腔粘膜病理性α-Syn聚集体这一技术的产生，在一定程度上填补了科研工作中检测PD口腔粘膜生物标记物α-Syn聚集体这一领域的空白，此外，基于该技术制备的PD诊断试剂盒和诊断仪实现了从科研向大规模临床应用的推广，解决PD早期诊断率低和生物标志物检测效率低的问题。本项目提供了无创、精准、低成本、可重复的PD的外周病理诊断方法，还可以用于前驱期预警预测，具有重要临床意义及产业化前景。

二、商业模式 （1）B2B模式 与生物技术公司合作,将技术集成到其现有产品中 与医疗设备制造商合作,集成入其自动化检测系统 （2）B2C模式 自主生产产品,面向各大医院、检测中心等直接销售 通过网络营销、学术推广等拓展终端市场 （3）检测服务模式 与医疗机构合作,在其现有的检测系统中加入该项检测 单独为医院或检测中心提供检测服务 （4）技术许可模式 将技术以许可方式授权给其他企业,获取许可使用费 （5）互联网医疗服务 在在线医疗服务平台上销售检测诊断试剂盒和提供检测服务 用户可以邮寄样本进行检测,并在线取得检测报告 （6）战略合作 与制药企业合作,将其作为新药药效评价的评估指标 与科研院所合作,探讨该技术的研发商业化方案

1）文章发表情况 申请人前期研究发现，PD患者的口腔粘膜细胞中病理性α-Syn表达水平显著高于健康人群。该研究结果已发表。 Zheng Y, Yu Z, Zhao J, Cai H, Wang Z, Wang X, Feng T. Oral Mucosa Derived α-Synuclein as a Potential Diagnostic Biomarker for Parkinson's Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 2022 Mar 28; doi: 10.3389/fnagi.2022.867528. 申请人前期采用RT-QuIC检测口腔粘膜中病理性α-Syn的种子活性，证实了口腔黏膜α-Syn种子活性可作为PD一种新的无创性诊断和前驱疾病的生物标志物。此外，从PD和MSA口腔粘膜中扩增出的α-Syn聚集物具有不同的生化和生物物理性质。该研究结果已发表。 Zheng Y, Yu Z, Cai H, Kou W, Yang C, Li S, Zhang N, Feng T. Detection of α-Synuclein in Oral Mucosa by Seed Amplification Assay in Synucleinopathies and Isolated REM Sleep Behavior Disorder. Mov Disord. 2024 May 7. doi: 10.1002/mds.29828. PMID: 38715177.

2） 专利申请 本项目团队已申请α-突触核蛋白在辅助诊断神经退行性疾病中的用途腔粘膜细胞α-Syn检测作为PD诊断标记物技术的国家发明专利（CN202210317186.8）和种子扩增法检测口腔粘膜来源α-突触核蛋白在辅助诊断神经退行性疾病中的用途（CN202311485842.6）的国家发明专利，以及PCT国际发明专利（PCT/CN2023/084456）。

3） 已完成单中心研究 本项目已在首都医科大学附属北京天坛医院完成单中心研究。单中心研究纳入研究对象包括107例PD患者、99例MSA患者、33例特发性快速眼动睡眠行为障碍（isolated rapid eye movement sleep behavior disorder ，iRBD）患者和103例健康对照（Health controls，HC）。使用SAA法检测口腔黏膜中α-Syn种子活性。结合形态、生化和生物物理方法分析了口腔粘膜α-Syn SAA产生的纤维。结构光照明显微技术（Structured Illumination Microscopy，SIM）图像显示，PD、MSA和iRBD患者口腔黏膜中不同病理形式的α-Syn相比HCs显著增高。口腔黏膜α-Syn SAA鉴别PD和HC的敏感性为67.3%，特异性为90.3%。MSA患者和iRBD患者口腔黏膜α-Syn SAA阳性率分别为53.5%和63.6%。此外，与PD患者相比，MSA产生的α-Syn纤维对蛋白酶K的消化具有更强的抵抗力和更强的细胞毒性。

4） 已研发诊断试剂盒原型 基于口腔粘膜细胞α-突触核蛋白检测的PD诊断试剂盒样品目前已研发成功。该诊断试剂盒原型的研发为进一步推进相关研究和应用奠定了基础。

5） 已经启动多中心验证 本研究已启动多中心验证研究。将从多中心入组患者，样本将在单中心研究单位北京天坛医院进行检测，以确保实验设备和技术的稳定性和协同性。将从以下两部分研究内容展开验证。 第一部分：进行应用RT-QuIC技术检测多中心样本来源口腔粘膜来源α-Syn种子活性作为PD诊断生物学标记物的验证 第二部分：开展口腔粘膜RT-QuIC体外扩增产生的α-Syn病理纤维的结构和功能特征的研究，进一步验证和深入探索口腔粘膜来源的α-Syn在PD发病机制中的作用,本项目团队在口腔粘膜样本检测和α-Syn相关研究方面具有良好基础，已申请α-突触核蛋白在辅助诊断神经退行性疾病中的用途（CN202210317186.8）和种子扩增法检测口腔粘膜来源α-突触核蛋白在辅助诊断神经退行性疾病中的用途（CN202311485842.6）的国家发明专利，以及PCT国际发明专利（PCT/CN2023/084456），目前已进入实质审查阶段。

帕金森病（Parkinson’s disease, PD）诊断主要依据病史和体格检查，但研究显示，病程5年内的PD诊断准确率仅有约53%1。PD早期诊断和前驱期预警对于预后改善和实施神经保护治疗具有重要意义，因此迫切需要寻找敏感性高、特异性强、重复性强的PD生物学标记物。PD的主要病理特征为黑质致密部多巴胺能神经元丢失和中枢神经系统路易小体/路易神经突形成2。路易小体的主要成分是错误折叠的α-突触核蛋白（α-Synuclein，α-Syn）聚集体3。理想的生物学标记物应与疾病的发病机制相关，α-Syn作为PD发病机制中的关键蛋白，一直是PD生物学标记物研究领域的热点4。由于脑部病理难以取材，PD的神经病理学确诊只能通过尸检实现5。然而，有证据表明，α-Syn的异常沉积不仅局限分布于脑部，而是广泛分布于外周组织、体液和细胞中6。这些研究提示可以通过在外周组织中检测α-Syn实现PD的早期病理诊断。在外周体液、组织或细胞中检测病理性α-Syn，是寻找新型PD生物标记物的方法之一。 在外周组织、体液和细胞中检测α-Syn作为PD诊断生物学标记物是该领域的研究热点。目前常用于PD生物学标记物研究的生物样本包括：血液、脑脊液、皮肤组织和唾液腺组织7。脑脊液是PD生物学标记物研究理想的生物样本，它能反映中枢神经系统的代谢和病理学特征4。研究显示，PD脑脊液中α-Syn聚集体和磷酸化α-Syn表达水平显著高于健康人群8。但由于获取脑脊液需要通过腰椎穿刺，这并非PD常规诊疗手段，临床推广存在一定困难。另外，有研究证实了PD皮肤、唾液腺组织中存在α-Syn异常沉积，尤其是磷酸化α-Syn9。但皮肤、唾液腺组织活检等操作存在创口出血和感染等有创风险，患者接受程度较低。相比之下，血液样本获取创伤较小，更容易被患者接受。然而，由于溶血影响、检测方法差异等因素的限制，现有研究结果异质性较大，还有待进一步证实10。目前外周组织采样多为有创性操作且采样难度大、患者依从性不佳。因此，目前亟需一种无创性、便捷的采样方法来实现PD早期诊断。,本项目的技术转化有望提升PD的早期诊断水平，为PD的个体化治疗提供帮助，降低医疗费用，具有重要的临床应用价值和社会效益。 本研究是首个应用RT-QuIC技术检测口腔粘膜来源α-Syn种子活性的PD生物学标记物研究。既往研究通常需要获取脑脊液或进行组织活检等创伤性操作，这使得样本的获取变得困难，且不符合PD患者的临床诊疗常规。相比之下， 与之相比，口腔粘膜细胞作为一种外周组织，具有安全无创、采样便捷的特点，因此被广泛应用于本研究中。 本研究是首个通过RT-QuIC体外扩增获取口腔粘膜来源α-Syn 病理纤维，通过结构和功能分析，探索其在PD发病机制中的作用研究。突触核蛋白病患者脑部存在不同分子构象的α-Syn病理纤维异构体。深入探讨不同构象α-Syn病理纤维的理化特征和形成原因，对揭示突触核蛋白疾病发病机制具有重要意义。 本研究是国际首创应用RT-QuIC技术检测口腔粘膜来源α-Syn种子活性的PD生物学标记物研究，也是是国际首创通过RT-QuIC体外扩增获取口腔粘膜来源α-Syn病理纤维，通过结构和功能分析，探索其在PD发病机制中的作用研究。这项研究填补了此前研究领域的空白，显著提高了样本获取的便捷程度，同时大大提高了临床可行性和可推广性。本研究团队已在帕金森病顶级期刊Mov Disord发表了第一篇关于应用RT-QuIC技术检测口腔粘膜来源α-Syn种子活性的PD生物学标记物研究。