新孢子虫谷氧还蛋白5（NcGRX5）的功能及其分子机制

20231207

农、林、牧、渔业

1. 构建了一种毒力减弱的新孢子虫株，该虫株的繁殖能力和对小鼠的致病力显著下降，有望成为预防新孢子虫感染的弱毒疫苗。其主要特征在于：缺失了谷氧还蛋白S16基因（grx S16）和谷氧还蛋白 C5基因（grx C5）的新孢子虫株。
2. 应用CRISPR/Cas9技术构建如权利要求1所述虫株，其特征在于包括以下步骤：

1. 基础新孢子虫虫株：为新孢子虫国际标准株Nc1，含有grx S16基因和grx C5基因。 2）通过PCR扩增、多片段连接方式获得构建弱毒虫株需要的两个质粒，分别是pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx S16质粒、pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx C5质粒、grx S16-5UTR:: DHFR:: grx S16-3UTR质粒和grx C5-5UTR:: CAT:: grx C5-3UTR同源模板质粒。 3）利用同源重组技术，经过药物筛选、单克隆筛选、PCR鉴定等获得新孢子虫grx S16和grx C5双基因缺失虫株（Δgrx S16Δgrx C5）。 4）该虫株的繁殖能力和毒力均显著降低，且具有良好的抵抗新孢子虫再感染的能力。

3. 所构建的新孢子虫grx S16和grx C5双基因缺失虫株在研制新孢子虫弱毒疫苗中的应用。 4.提供的Δgrx S16Δgrx C5虫株对小鼠有良好的免疫保护作用：分别设置双基因敲除虫株免疫组和未免疫对照组，免疫组腹腔免疫2000个Δgrx S16Δgrx C5速殖子，未免疫组腹腔注射相同剂量的PBS，共免疫两次，每次间隔两周。二免后15天，免疫组和未免疫对照组小鼠都腹腔接种1×107个Nc1速殖子，30天后统计小鼠存活率，发现免疫Δgrx S16Δgrx C5速殖子后，新孢子虫再感染时，小鼠的存活率为100%，未免疫组存活率为0%。说明Δgrx S16Δgrx C5虫株对小鼠抵抗野生型新孢子虫的感染具有良好的保护效果，有作为弱毒疫苗研发的潜力。 6.该虫株具有研发为牛和犬用新孢子虫病弱毒活疫苗的极大潜力。

新孢子虫是隶属于顶复亚门的专性胞内多种动物共患寄生原虫，在世界范围内广泛流行，其引起孕畜流产、死胎等繁殖障碍和神经肌肉疾病，对牛的危害最大，尤其是给奶牛养殖业造成巨大的经济损失，对犬的危害次之，引起犬的运动神经功能障碍，后肢瘫痪，跛行。由于新孢子虫寄生包囊阶段，一般药物不能进入包囊内，迄今为止，尚无可以广泛使用的动物新孢子虫病特效疫苗或药物。此外，牛新孢子虫病的主要危害是导致流产和死胎，往往在流产发生后才能发现疾病，而且感染牛中的多数牛并不发生所采用的防控方法只能是在有效检测的基础上，淘汰感染牛只，净化牛群，但该方法不仅有巨大的经济损失而且实际应用中难以推广。筛选新孢子虫生命活动中的关键蛋白，解析其致病的分子机制，对药物靶点筛选和疫苗研发具有重要价值，是近年来研究热点。 新孢子虫病的疫苗研究已经历经了虫体死苗、裂解蛋白苗、重组蛋白苗等等阶段，其中的虫体裂解苗曾经在欧洲注册，但由于免疫效果不确实，未能推广应用。随着基因调控表达技术在生物学领域的广泛应用，本课题组率先将基因敲除技术应用于新孢子虫的研究，构建了具有应用价值的新孢子虫基因缺失弱毒虫株，其在实验动物小鼠体内的具有良好的免疫效力，在牛和犬体内的免疫效力需要进一步研究。我国是养牛大国，犬的饲养量逐年上升，研究出新孢子虫病弱毒疫苗的价值是不言而喻的，仅仅用于牛的新孢子虫病疫苗就可减少牛流产率20%-40%，经济效益显而易见。 新孢子虫病是由新孢子虫（Neospora caninum）引起的多种动物共患原虫病，在世界范围内广泛流行。新孢子虫感染宿主后虫体快速增殖，形成大量速殖子，导致宿主的急性感染，引起新孢子虫病；在免疫力正常的宿主体内，机体抵抗力限制速殖子的快速增殖，速殖子转换为缓殖子，外被包囊壁，包囊内缓殖子进行缓慢增殖，包囊能够抵御宿主免疫系统和化学药物的攻击，使新孢子虫长期存在于宿主体内；当宿主妊娠或机体抵抗力下降时，包囊内缓殖子被激活进行快速增殖，再次形成大量速殖子，宿主再次进入急性感染状态。迄今尚未有效药物能够穿透包囊壁降低缓殖子存活和增殖能力。研发新孢子虫病疫苗是预防牛场和犬新孢子虫病的最终技术手段，在本项目和其他项目的支持下，我们构建了多个基因缺失虫株，在实验动物小鼠体内有良好的免疫效果，但是未在牛和犬体内进行实验，未来如果合作研究申报新型疫苗，对合作方的要求如下： 1.对方为生物产品公司或兽药生产企业，具备生产、销售动物疫苗或诊断试剂的能力和条件，具备200人以上规模的企业。 2.对方了解新孢子虫病在中国流行和危害现状，具备相关技术人员，在本方的培训下能够承担继续研发的专业水平和技术能力。 3.对方具备进行新孢子虫培养、犬实验感染和攻虫、牛的实验感染和攻虫等设施和技术能力。 4.对方具备进行新孢子虫生产工艺研发和改善的意愿和能力（设施和技术人员）。

可国（境）内外转让

新孢子虫是隶属于顶复亚门的专性胞内多种动物共患寄生原虫，在世界范围内广泛流行，其引起孕畜流产、死胎等繁殖障碍和神经肌肉疾病，对牛的危害最大，尤其是给奶牛养殖业造成巨大的经济损失，对犬的危害次之，引起犬的运动神经功能障碍，后肢瘫痪，跛行。由于新孢子虫寄生包囊阶段，一般药物不能进入包囊内，迄今为止，尚无可以广泛使用的动物新孢子虫病特效疫苗或药物。此外，牛新孢子虫病的主要危害是导致流产和死胎，往往在流产发生后才能发现疾病，而且感染牛中的多数牛并不发生所采用的防控方法只能是在有效检测的基础上，淘汰感染牛只，净化牛群，但该方法不仅有巨大的经济损失而且实际应用中难以推广。筛选新孢子虫生命活动中的关键蛋白，解析其致病的分子机制，对药物靶点筛选和疫苗研发具有重要价值，是近年来研究热点。 新孢子虫病的疫苗研究已经历经了虫体死苗、裂解蛋白苗、重组蛋白苗等等阶段，其中的虫体裂解苗曾经在欧洲注册，但由于免疫效果不确实，未能推广应用。随着基因调控表达技术在生物学领域的广泛应用，本课题组率先将基因敲除技术应用于新孢子虫的研究，构建了具有应用价值的新孢子虫基因缺失弱毒虫株，其在实验动物小鼠体内的具有良好的免疫效力，在牛和犬体内的免疫效力需要进一步研究。我国是养牛大国，犬的饲养量逐年上升，研究出新孢子虫病弱毒疫苗的价值是不言而喻的，仅仅用于牛的新孢子虫病疫苗就可减少牛流产率20%-40%，经济效益显而易见。

北京市自然科学基金面上项目

北京市科学技术委员会;中关村科技园区管理委员会

通过生物信息学分析发现，新孢子虫表达6个grx，分别定位于虫体不同位置，其中Ncgrx5 定位于线粒体。通过构建基因调控虫株进行研究，缺失Ncgrx5的虫株生命活动收到抑制，其入侵和增殖能力显著减弱，对小鼠的毒力显著下降。突变Ncgrx5 CGFS上的176位半胱氨酸，发现突变表型与敲除Ncgrx5后一致，证明其是关键活性位点。通过邻近生物素标记法，找到100多种Ncgrx5 的邻近蛋白，分析筛选出最可能的互作蛋白是铁硫簇装配转运的关键蛋白（Iscs、Iscu1、Iscu2、HSC70）。首先，在Ncgrx5-HA虫株中Iscs、Iscu2和Iscu1基因后面添加Flag内源性标签，确认Iscs、Iscu2与Iscu1均定位于线粒体；免疫共沉淀显示，Ncgrx5能与铁硫簇装配的关键蛋白Iscu1和Iscs互作。Ncgrx5缺失虫体的Fe-S簇装配上游通路的Iscs转录水平上升，Fe-S簇装配转运基因Iscu1和HSC70转录水平下降； Ncgrx5缺失后导致其互作蛋白Iscs和Iscu1线粒体上的定位发生变化，呈现无序的颗粒状，提示Ncgrx5在铁硫簇装配转运中发挥重要功能。对蛋白组和修饰组学分析发现， Ncgrx5缺失会影响线粒体电子传递链上的复合体I和复合体II中铁硫蛋白的表达量，同时会导致复合体Ⅰ上NADH 脱氢酶半胱氨酸残基上巯基的氧化修饰累积，处于谷胱甘肽化状态。比较grx5的基因缺失与过表达虫株，发现基因缺失虫株（Δgrx5）增殖能力显著下降。比较、分析蛋白质组和能量代谢组学的数据，Δgrx5虫株的线粒体呼吸链和TCA循环中的多种蛋白表达量下降，其相应的能量代谢产物也下降，表明GRX5影响新孢子虫线粒体能量代谢中多种酶的表达量和活性。利用BioID方法筛选出23种GRX5的邻近或互作候选蛋白，再利用Co-IP确认GRX5与铁硫簇合成关键蛋白ISCS和ISCU1互作，提示GRX5可能通过介导铁硫蛋白生物合成调节能量代谢。通过结构域分析发现GRX5第176位半胱氨酸（Cys176）可能是其发挥去谷胱甘肽化作用的关键活性位点。构建Cys176突变虫株（grx5C176A），比较研究显示grx5C176A虫株的增殖能力显著下降。通过氧化还原蛋白组学分析，筛选GRX5的去谷胱甘肽化底物蛋白，初步选定Δgrx5虫株的半胱氨酸上二硫化物含量显著上调的蛋白作为候选底物蛋白，结合BioID筛选到的GRX5邻近或互作蛋白数据进行更精确的筛选，确认MPPα和AAC蛋白是最可能的底物蛋白，二者均与GRX5共定位；利用Co-IP证实AAC与GRX5互作，MPPα不能与GRX5互作，推测GRX5通过与ACC互作调节AAC蛋白Cys174上硫醇/二硫化物平衡。 确认GRX5通过与铁硫簇合成关键蛋白互作，协同参与铁硫簇合成，并调节线粒体部分能量代谢；GRX5通过与AAC蛋白互作，并调节AAC蛋白 Cys174上的硫醇/二硫化物平衡。