木质素合成改造关键酶AsFMT的结构、机理及催化效率改造

20220110

农、林、牧、渔业

木质素是细胞壁中复杂的酚类高分子化合物，含量丰富，但利用率低，其工业预处理存在成本高、效率低、条件苛刻、污染严重等问题。因此，改造木质素使其容易降解已引起广泛关注。木质素单体-阿魏酰基转移酶（FMT）可催化木质素单体与阿魏酰辅酶A生成酯类偶合物，进而可在转FMT基因植物木质素中引入易断裂的酯键，是木质素改造的关键酶。FMT属于植物特有且功能重要的BAHD酰基转移酶家族，目前FMT的底物识别及催化机理尚未阐明，同时已知 FMT 中催化效率较高的当归AsFMT与底物木质素单体的亲和力不强，亟待进一步改造。本项目通过结构生物学的手段，解析了AsFMT的三维晶体结构，其展示出典型的BAHD酰基转移酶家族的折叠方式。与其他BAHD同源物的结构比较揭示了AsFMT与BAHD同源物相区别的几个独特的结构特征。分子对接研究表明，AsFMT中的T375可能起到稳定反应中间体的氧阴离子空穴的作用，并预测出H278在木质素单体亲核羟基结合中的作用。AsFMT的结构是首个以木质素单体为底物的BAHD家族蛋白的晶体结构，其结构的解析以及对其活性位点结构的分析对于揭示AsFMT的底物结合和催化机制具有非常重要的意义。项目成果为接下来对AsFMT进行改造和理性设计，提高其底物亲和力和催化效率，并后续在林业植物木质素合成改造中的应用奠定了基础。

科技成果转化过程中，将根据已有关于AsFMT的结构分析，找到FMT与底物结合中心及附近的关键位点氨基酸残基，对蛋白质进行半理性定向进化，按照饱和突变（CAST， Combinatorial active-site saturation test）的原则对几个特定靶点进行组合迭代饱和突变，利用分子动力学模拟等计算机技术对突变体文库进行模拟初筛，进一步，在体外和转基因植物（拟南芥及杨树）体内对突变进行小规模活性二次验证，筛选出与底物亲和力高，酶活性高，木质素整合能力强，工业处理木质素更容易降解的最优突变。转基因植物获取后将进行植物生长条件和表型测试，并在荧光显微镜下确定野生型和突变体FMT蛋白的表达情况。进而测试转基因细胞壁木质素含量、木质素单体组成比例、ML-FA偶合物整合及比例测试、纤维素定量分析和糖化测试。在科技成果转化对接拟合作方的需要方面，场地上需要一个可以繁育转基因植物的温室基地以及可以完成木质素相关技术参数测定的化学分析实验室。在人员方面，对方人员需要熟练掌握分子动力学模拟、转基因植物操作以及木质素化学分析方面的技术。对设备的需求主要包括高速运行模拟的计算机工作站、超高效液相色谱-质谱联用、气相质谱、荧光显微镜、酶标仪、等温滴定量热仪、化学发光分子成像仪、表面等离子共振成像仪以及组织培养室等。

仅限国内转让

作为最容易获取且储量巨大的可再生碳源，主要由木质素、纤维素和半纤维素组成的木质纤维素是理想的生物燃料和化工制品的替代原料。然而，木质素化学结构的复杂性不仅导致其自身利用率严重滞后，而且能影响纤维素水解酶等分解多糖，甚至是吸附聚集这些酶，使得酶解过程难以进行，极大影响生物燃料的生产。难以分解的木质素还成为了造纸业的主要污染物，而引入反应条件剧烈的木质素预处理环节既加大成本又对环境造成极大的危害。非常规木质素单体的存在使人们意识到木质素结构具有极强的可塑性，因此可以通过加入非常规木质素单体对木质素进行“重新设计”，产生“新型木质素聚合物”，其不影响植物生长发育，但引入了容易断裂的共价键从而使木质素更易于降解，降低工业利用的难度。因此，从源头上改造木质素的生物合成使植物细胞壁更易处理成为目前关注的热点问题。木质素单体-阿魏酰基转移酶（FMT）可催化木质素单体与阿魏酰辅酶A生成酯类偶合物，进而可在转FMT基因植物木质素中引入易断裂的酯键，是木质素改造的关键酶。本项目通过结构生物学手段，解析了AsFMT的结构，揭示其底物识别和催化机制，接下来可基于其结构，对其底物亲和力进行优化改造，提高其底物亲和力和催化效率，为后续改造林业植物木质素的合成，深入开展生物、化工等多学科交叉融合，提高木质素利用率，降低环境污染奠定基础，因此具有重要的经济和社会效益。

北京市自然科学基金青年项目

北京市科学技术委员会;中关村科技园区管理委员会

木质素是细胞壁中复杂的酚类高分子化合物，含量丰富，但利用率低，其工业预处理存在成本高、效率低、条件苛刻、污染严重等问题。因此，改造木质素使其容易降解已引起广泛关注。木质素单体-阿魏酰基转移酶（FMT）可催化木质素单体与阿魏酰辅酶A生成酯类偶合物，在植物木质素中引入易断裂的酯键，是木质素改造的关键酶。FMT属于植物特有且功能重要的BAHD酰基转移酶家族，目前FMT的底物识别及催化机理尚未阐明，同时已知 FMT 中催化效率较高的当归 AsFMT 与底物木质素单体的亲和力不强，亟待进一步改造。本项目通过结构生物学的手段，解析了AsFMT的三维晶体结构，其展示出典型的BAHD酰基转移酶家族的折叠方式。与其他BAHD同源物的结构比较揭示了AsFMT与BAHD同源物相区别的几个独特的结构特征。分子对接研究表明，AsFMT中的T375可能起到稳定反应中间体的氧阴离子空穴的作用，并预测出H278在木质素单体亲核羟基结合中的作用。综上所述，本项目的成果为研究AsFMT催化的反应提供了重要的结构信息，为后续对AsFMT的理性设计和改造以提高其底物亲和力和酶催化效率，及其在木质素工程中的应用奠定了基础。