肝癌特异性外泌体在原发性肝癌(早期)诊断及病情检测中的作用研究

20241222

外泌体被称为“液体活检的三驾马车”之一， 它是由细胞分泌的小囊泡，外泌体携带大量亲代细胞的蛋白质、DNA、mRNAs、miRNAs等，可以作为癌症诊断和预后的标志物。癌细胞分泌外泌体的数量是正常细胞的10倍，每天约可分泌1000-10000个外泌体，因此在肝癌早期，人体血液中即有大量的肝癌细胞分泌的外泌体，这些外泌体携带有肝癌特异性的蛋白（AFP、GPC3等），通过检测肝癌特异的外泌体即可发现早期肝癌的踪迹，用于肝癌的早期诊断和筛查。 随着现代科技的发展，纳米流式、量化成像流式等细胞仪可以检测到纳米级的外泌体颗粒，流式细胞仪检测速度快，灵敏度高，可以精确到单个外泌体，因此可以通过检测血液中肝癌特异的外泌体，对肝癌进行早期诊断。 我们前期使用Amnis量化成像流式细胞仪成功检测到肝癌特异性（AFP+、GPC3+）的外泌体，并发现原发性肝癌患者血浆中AFP+外泌体和GPC3+外泌体比正常人与慢乙肝患者明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。结果显示与血浆AFP含量无关，这或许为血浆AFP阴性肝癌患者提供了更好的检测方法和技术。

肝癌是我国第二大肿瘤致死病因，早诊率低，早期诊断潜在需求大。根据《Journal Of Hepatology》数据显示，目前我国肝硬化患者（700万）和肝炎患者（HBV携带者9000万，HCV携带者1000万）合计约1.07亿人，而非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和酒精性肝病（ALD）人群规模也非常庞大。根据Frost&Sullivan预测，2023年我国将有1.2亿人肝癌高风险人群。由于肝癌进展较快，高危人群筛查频率较其他癌症高，西南证券研究报告显示，在不考虑市场渗透率的情况下，我国肝癌早筛、早诊市场空间达到2000亿元。因此我国肝癌早诊市场前景广阔，早诊市场需求巨大。 我国每10万人中就有35人患有肝癌，按每人平均10万手术治疗及放/化疗费用计算，我国每年新发肝癌治疗总费用支出在约500亿人民币左右。目前，我国肝癌的五年总生存率为12.1%，距离《国务院关于实施健康中国行动的意见》提出的，到2030年我国总体癌症5年生存率不低于46.6%的目标仍有一定差距。肝癌患者如果能在早期或极早期发现并进行干预，施行根治性治疗，可明显提高肝癌患者5年生存率，显著改善患者的生活质量，减少国家整体医疗卫生支出，具有巨大的经济价值和社会效益。 本研究拟弥补目前肝癌早期诊断手段不灵敏，筛查率不足的缺陷，利用流式细胞检测血浆中肝癌特异性外泌体方法对肝癌患者进行筛查，预期提高早期肝癌的检出率，延长患者生存期并降低死亡率，为患者节省诊断和治疗花费，并减轻医院诊疗负担，节省国家医疗开支。同时，生存期的延长和死亡率的降低也会减轻患者家庭的负担，有利于家庭团结和社会和睦，产生正面的社会效益，在肿瘤诊断研究方面具有建设性的推动作用。

1.建立外泌体提取及流式细胞仪检测肝癌特异外泌体的方法（已完成） 使用标准化的纳米磁珠作为内参和外参，建立了外泌体提取标准操作流程（SOP）。对外泌体上肝癌特异性蛋白AFP、GPC3、EpCAM、ASGPR1进行标记，然后使用Amnis量化成像流式细胞仪对这些蛋白进行检测。 2.肝癌特异性外泌体在原发性肝癌早期诊断中的作用研究 2.1肝癌特异性外泌体在不同人群中的含量检测（已完成AFP和GPC3的检测） 检测健康对照、慢性乙型肝炎、肝硬化、原发性肝癌患者血浆外泌体上肝癌相关蛋白（AFP、GPC3、EpCAM、ASGPR1）的表达水平，确定肝癌特异性外泌体在几组人群中的表达差异，明确其作为肝癌诊断标志物的敏感性及特异性。通过ROC曲线下面积，进一步确定其作为肝癌诊断标志物的最佳效能，并优化临界值切点（cut-off）值。 2.2 肝癌特异性外泌体在肝癌不同分期中的含量检测 检测肝癌早、中、晚期（CNLCⅠ、Ⅱ、Ⅲ期）患者血浆外泌体上肝癌相关蛋白（AFP、GPC3、EpCAM、ASGPR1）的表达水平，确定肝癌特异性外泌体在肝癌不同分期人群中的表达差异，明确其作为早期肝癌诊断标志物的敏感性及特异性。通过ROC曲线下面积，进一步确定其作为早期肝癌诊断标志物的最佳效能，并优化临界值切点（cut-off）值。 2.3 肝癌特异外泌体为肝癌诊断标志物的特异性研究 检测胃癌、结肠癌、食管癌患者血浆外泌体上肝癌相关蛋白（AFP、GPC3、EpCAM、ASGPR1）的表达水平，进一步确定肝癌特异性外泌体在这几组人群中的表达差异，明确其作为肝癌诊断标志物的特异性。 3. 肝癌特异性外泌体作为肝癌病程进展及预后监测标志物的研究 检测肝癌治疗（介入、手术）前后患者血浆外泌体上肝癌相关蛋白（AFP、GPC3、EpCAM、ASGPR1）的表达水平，术后7天、1月、3月、6月、1年直至复发，每半年定期随访，明确肝癌特异性外泌体在治疗前后的动态变化，进一步阐明作为肝癌病程进展及预后监测标志物的可能性。 4. 综合数据分析，明确肝癌特异性外泌体单独或联合对早期原发性肝癌的精准诊断研究。 分析外泌体上4个肝癌特异性蛋白AFP、GPC3、EpCAM、ASGPR1单独或联合对早期肝癌诊断的敏感性和特异性，明确单独或联合应用对早期肝癌诊断的效能差别，确定最佳组合方式，达到敏感性、特异性最优，提高肝癌早期诊断。 5.技术研发及成果转化 在上述研究发现的基础上，实现肝癌特异性外泌体早期诊断肝癌及肝癌病程监测、预后新技术的研发，完成专利申请，与北京益微生物科技有限公司签订正式合作协议，最终实现成果转化。,本项目已在前期研究中发现，AFP+外泌体和GPC3+外泌体在原发性肝癌患者血浆中的显著升高，并具有统计学意义。计划进一步研究不同人群、不同分期以及治疗不同时间点的外泌体变化，以明确其在肝癌诊断中的作用。

原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类生命健康。肝癌的早发现、早诊断、早治疗是提高肝癌疗效的关键。但我国目前仍缺乏早期肝癌敏感、特异的精准诊断指标。因此，探索用于早期原发性肝癌诊断的新方法或诊断指标对延长患者生命、降低肝癌死亡率具有重要意义。,肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，据相关数据显示，2022年中国肝癌新增人数41万例，死亡人数为39万例，是死亡率仅次于肺癌的第二大恶性肿瘤。全球范围内，肝癌发病排名第6，死亡排名第3，每年约有 90 万例新病例和 83 万例死亡，据WHO 预测到 2040 年将有超过 130 万人死于肝癌，我国肝癌发病人数占全球肝癌人数的50%，肝癌严重威胁着我国人们的生命健康。 虽然肝癌发病率高，但由于目前我国肝癌缺乏敏感、特异的早期诊断指标，同时肝癌起病隐匿，早期不容易发现，因此超过57%的患者在第一次诊断时已达中晚期或终末期，失去最佳的治疗时机。据统计，我国肝癌5年生存率仅为12.1%（图1）。如果能实现肝癌的早期诊断，可将患者的5年生存率提高到50%-75%。因此，早期诊断是降低恶性肿瘤死亡率的有效途径，可以前移癌症被诊断和治疗的时机。探索更为有效的原发性肝癌诊断方法或策略，对于提高肝癌的早诊率，延长肝癌患者生命、降低肝癌死亡率具有重要意义，目前具有非常强的医疗需求。 图1 2021-2017年中美癌症5年生存率对比 前期使用Amnis量化成像流式检测到肝癌特异性甲胎蛋白阳性（AFP+）和磷脂酰肌醇蛋白多糖-3阳性（GPC3+）的外泌体，并发现AFP+外泌体和GPC3+外泌体在原发性肝癌患者血浆中明显升高，与正常对照、慢乙肝、肝硬化患者比较有相比差异有统计学意义（P<0.05），对肝癌的早期诊断及病情监测可能具有重要意义（正在申请专利）。